企业资讯丨难转染细胞基因导入难,Takara病毒载体系统来破局

企业   2024-11-28 17:05   北京  

病毒载体作为一种外源基因导入工具已经被广泛使用,可以在哺乳动物细胞中高效导入和表达目标外源基因,尤其对于不适用阳离子脂质体、阳离子聚合物等转染试剂的细胞类型,病毒载体不失为一种理想选择。目前常用的病毒载体有慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒等等。不同病毒载体的关键属性不同,基于实验目标选择合适的病毒基因递送系统通常具有一定的挑战性,需要根据病毒载体的关键属性去做选择。

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病毒载体的关键属性

宿主细胞范围:大多数病毒载体都是经过改造优化的,能够感染广泛的细胞类型。对于依赖于宿主细胞表面受体来感染的病毒载体,可感染的宿主细胞通常具有一定的特异性。

能否有效感染分裂和不分裂的细胞:对应依赖细胞分裂周期感染宿主细胞的病毒载体,只有细胞有丝分裂活跃的细胞类型才能被有效感染,而不能有效感染静止细胞或者分裂缓慢的细胞。

基因组是否发生整合:能够在宿主细胞基因组中发生整合的病毒载体,有利于构建稳转细胞,让外源基因可以持续稳定地在宿主细胞中存在。不能整合的病毒载体导入的外源基因,游离存在于宿主细胞中,外源基因的存在也会随着细胞分裂增殖而被稀释。经过人工改造的AAV载体基因组,虽然以游离体的形式存在于细胞内,但有文献发表也会观察到随机的整合。(Deyle D. R. and Russell, D. W. Adeno-associated virus vector integration. Curr. Opin. Mol. Ther. 11, 442–447 [2009].)

表达外源蛋白质的水平如何:不同病毒载体蛋白质表达能力不同,像慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒这些病毒类型通常外源蛋白质的表达能力相对较低,而腺病毒的表达水平就要更高一些,在HEK 293细胞中可以达到总蛋白质水平的10-20%,这是因为腺病毒在宿主细胞中具备非常高的拷贝数。不过,如果慢病毒在高MOIs情况下,也能实现高的表达水平。

外源基因的容纳能力:不同的病毒载体可以容纳的外源基因的大小不同。不同病毒载体,原始野生型的基因组大小本就有区别,可以容纳的外源基因的能力也是有区别的。另外,荧光蛋白标记基因、抗性筛选基因等序列的存在也将压缩可克隆的外源基因的空间。如果插入的外源基因过大,人为制造出一个比野生型基因组更大的基因组,将会导致病毒粒子不稳定,并且病毒滴度也会明显降低。

各种病毒载体特点简介

慢病毒(Lentivirus)

慢病毒是目前细胞与基因疗法研究,尤其是CAR-T治疗,所使用的主要基因导入平台。慢病毒是单链RNA病毒,大多以人免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础开发,可用于绝大多数哺乳动物细胞基因导入,包括使用逆转录病毒难以实现的造血干细胞及神经细胞等在内的非分裂细胞。使用重组慢病毒导入的目的基因也可以整合到宿主细胞的基因组中,可实现长期稳定的基因表达。

逆转录病毒(Retrovirus)

逆转录病毒在基因治疗方面有着丰富的应用实绩,但由于它相对慢病毒更容易引起插入性随机突变,近几年来应用较少。逆转录病毒也是单链RNA病毒,一般基于莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)开发。逆转录病毒能够将基因导入至多数处于增殖期的细胞中,由于导入基因可整合到染色体中,因此可以实现长期稳定的基因表达。重组逆转录病毒制备相对容易,但仍然需要在P2级实验室条件下操作。

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus)

作为体内基因导入主要平台之一,AAV已经在多个遗传性眼科疾病治疗临床试验中显现出明显的治疗效果,而且不会引起显著的不良免疫反应。AAV也是一种广泛应用于癌症基因治疗的病毒载体,多种AAV载体已被用于肿瘤治疗,众多临床前研究结果显示,AAV基因治疗成功抑制肿瘤生长,致使肿瘤消退。另外,AAV还广泛应用于血液病、代谢类等疾病的治疗研究,展现出了广阔的应用前景。

由于AAV免疫原性和细胞毒性低,能够转导非分裂细胞,并且整合到宿主基因组中的频率非常低,因此被众多研究学者认为安全性更高。经过重组和改造的AAV拥有不同的血清型,根据血清型不同而具有不同的宿主范围和病毒特征,可以有效作用于特定细胞类型,包括分裂和非分裂细胞类型。使用者需要根据靶标细胞或者组织类型选择适合的血清型,目前使用频率较高的血清型为AAV2,其它血清型也逐渐被广泛使用。

腺病毒(Adenovirus)

腺病毒是将基因导入哺乳动物细胞的可靠平台之一,早先也被应用于基因治疗研究,但现在应用较少。腺病毒的感染不依赖于细胞周期,所以可以将目标基因传递给原代或者经过转化的细胞系。在感染后细胞中,由于重组腺病毒基因组以多拷贝形式存在,目标基因将以高水平瞬时表达,腺病毒具有在哺乳动物细胞中高效生产蛋白质的优势。此外,腺病毒能够感染多种不同动物物种的增殖和静止细胞类型,适用范围广。

Takara Bio作为生物行业知名品牌,在病毒基因导入系统方面深耕多年,拥有技术出色/先进、品控稳定的慢病毒系统、逆转录病毒系统、腺相关病毒系统、腺病毒系统全套解决方案,为生物学领域基础研究以及CGT、疫苗等应用研究护航加码。

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