山东大学闫震课题组ES&T：阐明了产甲烷古菌对于砷的分子转化机制

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近日，山东大学闫震教授团队在Environmental Science & Technology上发表了题为“Molecular Basis of Thioredoxin-Dependent Arsenic Transformation in Methanogenic Archaea”的研究论文。已知产甲烷古菌在砷（As）生物地球化学循环中起着至关重要的作用，然而，人们对产甲烷生古菌介导的As转化的分子机制仍然知之甚少。本文报道了产甲烷古菌对砷的氧化还原和甲基化特性。研究表明，在产甲烷生长的指数期，通过细胞质As还原酶（ArsC）介导As (V) 的还原，在固定阶段通过细胞质As (III) 甲基转移酶（ArsM）介导As (III)的甲基化 ；ArsC催化的As (V) 还原和ArsM催化的As (III) 甲基化表明， MA4683编码的硫氧还蛋白（Trx）优先用作ArsC和ArsM的生理电子供体，提供了甲烷生成和As 转化之间的氧化还原联系；ArsC和ArsM与Trx的结构采用AlphaFold-Multimer建模，对复合物相互作用位点的关键半胱氨酸残基进行了定点突变，结果表明，与细菌ArsC或真核ArsM相比，古菌ArsC和ArsM使用了进化上不同的二硫键与Trx相互作用。本研究为 As在产甲烷古菌中转化的生理作用和潜在机制的理解提供了重大进展。

砷的生物地球化学循环与环境安全和人类健康密切相关，不同砷物种之间存在毒性和流动性的差异。砷的循环机制主要包括砷氧化、还原、甲基化和去甲基化等，各种微生物在As的生物地球化学循环中发挥作用已被证明，然而，微生物介导的砷转化的分子机制仍未阐明，特别是关于产甲烷古菌，这是一组在缺氧环境中广泛存在的专性产甲烷的微生物。

As的还原过程中，谷胱甘肽（GSH）和硫氧还蛋白（Trx）系统分别是革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌ArsC的电子供体。含有硫醇的化合物GSH和Trx已被证明在细菌 ArsM催化的As（III）甲基化中发挥作用。由于产甲烷古菌中缺乏GSH，一种含硫醇辅酶M（HSCoM）是甲烷生成的必要辅助因子，被鉴定为比GSH更有效的电子供体。此外产甲烷古菌中存在Trx这一广泛的氧化还原系统，它作为产甲烷古菌中ArsM的还原当量的作用仍有待评估。

本研究旨在促进对产甲烷菌介导的砷循环转化的理解，并进一步了解产甲烷古菌中酶催化转化砷的分子机制。选择模型产甲烷古菌Methanosarcina acetivorans作为本课题的研究对象，探究微生物介导的砷的生物地球化学循环。

图文导读

M.acetivorans 介导As(V)还原和As(III)甲基化

图1 不同浓度As (V) 下M. acetivorans的生长参数和胞外As（III）分析

(A) 生长曲线。(B) 生长过程中甲烷的产生。通过HPLC−ICP−MS测量的M. acetivorans在含有10 (C)或150 (D) μM As(V)培养下的胞外As(III)丰度。

在指数阶段，添加低浓度（10 μM）的As(V) 刺激甲烷产生和M. acetivorans的生长；然而，添加高浓度（100−250μM）As (V)导致了剂量依赖的抑制作用，表明As (V)对M. acetivorans生长的毒性作用。在添加10或150 μM As (V)的培养基中，观察到细胞外As（III）的浓度增加；然而，在产甲烷生长的固定阶段（5−10天），细胞外As（III）的浓度保持不变。从第3天到第10天，添加10或 150 μM As (V)的无菌培养基表现出稳定的As(III)浓度，表明在高盐培养基中还原剂可能会还原As(V)。然而，在第5天10和150μM As (V) 产甲烷生长过程中，化学还原仅为As (V)的23.24和28.8%，这些结果表明，在产甲烷生长的指数阶段，M. acetivorans表现出还原As (V)的能力。

图2M. acetivorans 产甲烷生长过程中As (V)减少分析

(A) 通过检索M. acetivorans基因组推测的As (V)还原途径。(B) 利用CRISPR/Cas9技术构建ΔarsC菌株。利用Cas9的高效切割功能和包含NotI切割位点的特异性同源修复片段，完成了arsC中43-bp序列的缺失。ΔarsC菌株的详细失活步骤和构建验证如图S2所示。(C) 10 μM As (V)生长的M. acetivorans的WT和ΔarsC菌株的细胞外As（III）丰度。(D) 150 μM As (V)生长的M. acetivorans 的WT和ΔarsC菌株的细胞外As（III）丰度。

分析M. acetivorans基因组，MA3103编码ArsC（以下简称MaArsC），与革兰氏阳性菌的ArsC有~ 45%的相似性。此外，还获得了编码As（III）外排泵的推测基因MA4353，负责从细胞中排出As(III)，然而，并未发现在能量保护过程中使用As (V)作为最终的电子受体与呼吸 As (V) 还原酶具有同源性的相关基因。通过使用CRISPR/Cas9技术灭活染色体MA3103位点，评估了假定的MaArsC在As (V)还原中的催化作用，在10和150 μM As (V)存在下，MA3103位点的失活导致细胞外As(III)分别减少了84.1%和69.1%。这些结果表明，MaArsC介导了产甲烷生长过程中As (V)的减少。

M.acetivorans已被证明通过MA3783编码的ArsM（以下简称MaArsM）在生长固定期介导As(III)到一甲基砷（MMA）的甲基化。本研究获得的结果与上述观察结果非常相似，添加10 μM As (V)或As(III) 在产甲烷生长的第20天，生成 5% - 10% MMA。然而，在产甲烷生长过程中没有检测到甲基化的化合物。

MaArsC和MaArsM催化的As (V)还原和As(III)甲基化的表征

MaArsC能够使用三种电子供体来还原As (V)。当Trx7作为电子供体（0.241 U/mg）时，MaArsC的活性显著高于GSH（0.0216 U/mg）和HSCoM（0.0239U/mg）。此外，MaArsC对Trx7具有更高的亲和力，Km为4.83 μM，而对GSH和HSCoM的亲和力更低，Km分别为54.3和37.0 μM。MaArsM也能够利用三种电子供体催化As(III)甲基化为MMA和二甲基砷（DMA）。Trx7作为电子供体（0.107 U/mg）时，MaArsM的活性显著高于GSH（0.0348 U/mg）和HSCoM（0.0394 U/mg）。MaArsM对Trx7（Km为448 45.1 μM）的亲和力高于对GSH和HSCoM，Km分别为8547和6873 μM。这些结果表明，与GSH和 HSCoM相比，Trx7是MaArsC和MaArsM催化As转化的首选电子供体。

Trx7与MaArsC和MaArsM的氧化还原相互作用

图3 Trx7与MaArsC和MaArsM的氧化还原依赖相互作用

(A)用Alphafold-Multimer对MaArsC与Trx7的的配合物中进行建模。(B)用Alphafold-Multimer对MaArsM与Trx7的的配合物中进行建模。Trx7的两个活性位点半胱氨酸显示为青色，而MaArsC或MaArsM的相邻半胱氨酸显示为银色。(C) 测量WT和ArsC突变体的As (V)还原活性。(D) 测定WT和ArsM突变体的As(III)甲基化活性。

使用AlphaFold-Multimer对Trx7和MaArsC或MaArsM的复合物的结构进行了建模。Trx7-MaArsC和Trx7- MaArsM生成的模型分别获得了高置信度和中置信度（模型置信度，分别为≥0.8和≥0.49）。

复合物Trx7-MaArsC生成的模型显示，Trx7的两个活性位点半胱氨酸残基（Cys12和Cys15）与MaArsC的三个空间相邻的半胱氨酸残基（Cys89、Cys96和Cys99）紧密对接。ArsC催化As (V)还原过程中，有可能产生一个或多个分子内二硫键；这些分子内二硫键是与Trx7的潜在相互作用位点，从而使ArsC的还原状态再生。通过丝氨酸取代确定MaArsC三个空间相邻的半胱氨酸残基Cys89、Cys96和Cys99的作用，分别生成突变体C89S、C96S和C99S。这些突变体使用Trx7作为电子供体，突变C96S不再拥有催化还原As(V)的能力，而突变体C89S和C99S保留15.26和35.39 %的As (V)还原能力。这些结果表明，MaArsC的Cys96通过与Cys89或Cys99形成二硫键，从而与Trx7建立的相互作用。

复合物Trx7-MaArsM生成的模型显示，Trx7的两个活性位点半胱氨酸残基（Cys12和484 Cys15）与MaArsM的两个空间上相邻的半胱氨酸残基（Cys24和Cys25）紧密对接。残基Cys24或Cys25可能与两个空间相邻的半胱氨酸残基（Cys62和488 Cys150）形成二硫键；这些分子内二硫键是与Trx7相互作用的位点，从而使ArsM进行连续甲基化。将MaArsM的4个空间相邻半胱氨酸残基Cys24、Cys25、492 Cys62和Cys150突变为丝氨酸，分别产生C24S、C25S、C62S和C150S。利用Trx7作为电子供体对这些突变体的活性进行评估，发现C25S、C62S和C150S表现出甲基化活性完全丧失，而突变体C24S的活性与野生型酶相当。这些结果表明，MaArsM的残基Cys25，Cys62和Cys150通过二硫键的形成与Trx7建立相互作用。

甲烷生成与砷转化相耦合

图4 As (V)还原和As(III)甲基化与甲烷生成途径的结合

MP：甲氧苯嗪；HdrDE：膜结合异二硫还原酶；Fpo：膜结合F₄₂₀脱氢酶；Rnf：红杆菌固氮复合物；HSCoM：辅酶M；HSCoB：辅酶F₄₂₀；还原铁氧还蛋白；CH₃−SCoM：甲基辅酶M；CHO−H₄SPT：亚甲基四氢蒽脲；FNO：F₄₂₀H₂：NADP⁺氧化还原酶；FNR：铁氧还蛋白：NADP⁺氧化还原酶；TrxR：硫氧还蛋白还原酶；Trx7：硫氧还蛋白7；ArsC：As (V)还原酶；ArsM：As(III)甲基转移酶。

还原铁氧还蛋白（Fd_red）和还原辅助因子F₄₂₀（F₄₂₀H₂）是通过M. acetivorans的甲基营养或乙酰分解甲烷生成的还原当量。MA3103位点编码的MAArsC蛋白通过产生MA3103突变株催化As (V)的还原。鉴于MaArsC与来自革兰氏阳性细菌的ArsC的高度同源性，以及后者酶依赖于硫醇/二硫醚氧化还原系统进行As (V) 还原，Fd_red或F₄₂₀H₂不太可能是MaArsC的直接电子供体。然而，Fd_red和F₄₂₀H₂可以通过M. acetivorans中的某些途径为NADP⁺提供电子：Fd_red：NADP⁺氧化还原酶（Fnr）和F₄₂₀H₂：NADP⁺氧化还原酶（Fno）两种途径。由此生成的NADPH可以随后通过TrxR将电子传递给特征硫醇/二硫氧化还原蛋白Trx7，从而进行砷的还原和甲基化。在生理条件下，Trx7已被确定为MaArsC和MaArsM的首选电子供体，提供了甲烷生成和As转化之间的联系。

MaArsC和MaArsM分别催化As (V)还原和As(III)甲基化的催化机理

图5MaArsC和MaArsM分别催化As (V)还原和As(III)甲基化的催化机理

(A)Trx7与MaArsC的相互作用。①Cys96攻击Cys89，形成Cys89-Cys96二硫键，为As (V)还原提供电子。②二硫键Cys89-Cys96被Trx7还原，生成还原性的MaArsC，③或Cys99通过二硫级联攻击Cys96，形成Cys96-Cys99二硫键。④二硫键Cys96-Cys99被Trx7还原，从而再次生成还原性的MaArsC。(B) Trx7与MaArsM的相互作用。①As(III)首先被甲基化为MMA，并产生一个Cys25-Cys62二硫键。②Cys25-Cys62二硫键被Trx7还原，然后进行第二轮甲基化。③Cys150攻击Cys62形成Cys62-Cys150二硫键，MMA进一步甲基化形成DMA。④最后，Cys62-Cys150二硫化物被Trx7还原，允许循环重新开始。

两个分子内二硫键的形成以级联方式配合构象变化完成催化过程的结论在之前已经报道，在SaArsC的活性位点p环，二硫键之间形成级Cys82和Cys89二硫键，并推测该二硫键与Trx相互作用，本研究得到的结果证实了这一推测。MaArsC与Trx7的分子对接分析显示，Trx7与该酶的残基Cys89和Cys96紧密对接，分别对应于SaArsC的Cys82和Cys89。然而，存在额外的残留Cys99距离~10Å，提高了Cys89和Cys96攻击Cys99的可能性，造成第二个二硫键级联从而引起构象三元结构变化。这些结果表明，与来自细菌的ArsC相比，来自产甲烷古菌的ArsC可以在As (V)还原过程中产生额外的二硫键级联，从而为ArsC的再生提供了一个替代的途径。

已有文献解析Cyanidioschyzon merolae（以下简称CmArsM）的ArsM晶体结构。CmArsM与甲基供体SAM的结合位点已经被发现，但是与电子供体Trx的相互作用位点仍然未知。通过将MaArsM的预测结构与已知结构对比，并进行相关氨基酸的突变，从而提出了依赖于Trx7和二硫键生成的甲基化过程，即甲基化MMA生成可能伴随着Cys25和Cys62形成第一个二硫键从而引起三元结构的构象变化，这个二硫键可能被Trx7打开从而进行连续的甲基化。MMA随后甲基化为DMA，伴随着Cys62和Cys150之间第二个二硫键的形成，然后被Trx7攻击，导致还原ArsM的再生。

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文章以模式产甲烷古菌Methanosarcina acetivorans为研究对象，明确了M. acetivorans在产甲烷生长的对数期将As (V) 还原为As (III) ，在产甲烷生长的稳定期将As (III) 甲基化。利用Crispr/Cas9基因编辑技术揭示了由MA3103与MA3783编码的ArsC与ArsM分别是M.  acetivorans对于As(V)还原与As(III)甲基化的关键酶。通过在大肠杆菌中异源表达MA3103与MA3783并利用重组蛋白N端的组氨酸标签进行蛋白纯化，通过体外酶活测试并进行酶促反应动力学分析，确定古菌中Trx7是ArsC与ArsM的最适电子供体。运用Alphafold-Multimer预测了Trx7与ArsC和ArsM的蛋白互作位点，对其进行定点突变，揭示了Trx7与ArsC和ArsM的互作机理，阐明了产甲烷古菌不同于细菌的砷转化机制。本研究拓展了砷在全球甲烷动力学背景下生物地球化学循环的理解，揭示了砷循环和甲烷循环之间的相互耦合关系，为调节全球甲烷通量，探究微生物介导的砷的生物地球化学提供理论支撑。

本研究得到了国家自然科学基金青年与面上项目、泰山学者青年专家项目、山东省优青项目与山东大学齐鲁青年学者项目的资助。