河海大学罗景阳团队WR：非抗生素消毒剂同步干扰污泥厌氧消化过程甲烷产量及抗生素抗性基因的传播与作用机制

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近日，河海大学环境学院罗景阳教授团队在环境领域著名学术期刊Water Research上发表了题为“Non-antibiotic disinfectant synchronously interferes methane production and antibiotic resistance genes propagation during sludge anaerobic digestion: Activation of microbial adaptation and reconfiguration of bacteria-archaea synergies”的研究论文。剩余活性污泥（WAS）具有丰富的资源回收潜力，但其赋存的外源污染物也伴随着较大的环境风险，对实现其高效资源化与无害化处理带来挑战。厌氧消化是针对污泥等有机固废实现绿色、可持续处理的高效途径之一，但其处理效率易受到有毒有害污染物的影响。聚六亚甲基胍（PHMG）作为一种广泛使用的非抗生素类消毒剂，在半连续流条件下对WAS厌氧消化的影响及潜在机制尚不清楚。研究发现，甲烷（CH₄）产量从对照组的16.1 mL/g VSS下降到13.2 mL/g VSS（低PHMG）和0.3 mL/g VSS（高PHMG）。同时，PHMG胁迫下，抗生素抗性基因（ARGs）的丰度增加了4.6-12.7%。分子对接分析表明，PHMG可以自发地与WAS结合并分解WAS，增加了微生物接触PHMG的可能性。这导致细菌数量的增加和古菌数量的减少，从而使细菌在消化体系中占据主导地位。PHMG反应器的网络拓扑指数低于对照组，负相关链接比例更高，表明细菌与古菌之间的拮抗关系更强。此外，PHMG显著干扰了参与CH₄生物合成的关键基因（如mch和mtd）。值得注意的是，在低PHMG胁迫下，产甲烷古菌活性和趋化性（如rfk和cheA）得到部分恢复，这种适应过程也促进了ARGs通过水平基因转移进行传播。本研究证实了PHMG的生态环境风险，进一步强调了制定并实施有效的新污染物处置策略的重要性。

厌氧消化是实现污泥等有机固废资源化处理的绿色、可持续途径之一。它不仅能将有机物转化为高价值的化学物质，如挥发性脂肪酸（VFAs）和甲烷（CH₄），而且还减轻了包括ARGs在内的污染物的扩散。作为一种主要由微生物驱动的过程，容易受到外源新污染物（ECs）等干扰。微生物共生在自然生态系统中普遍存在，在生态功能和厌氧消化中发挥着至关重要的作用。通常而言，古菌比细菌更容易受到ECs的干扰，它们的共生网络往往更容易受到环境压力的影响。然而，厌氧消化系统中ECs对细菌-古菌共生网络的干扰反应尚不清楚。微生物群落的动态变化，特别是细菌和古菌之间的相互作用，以及相关的功能基因（如参与甲烷生物合成和适应机制），可以直接影响WAS的厌氧消化性能和ARGs的命运。值得注意的是，广泛使用的消毒剂PHMG具有很强的消毒特性，可能会破坏微生物的活性和功能。然而，细菌-古菌共生关系如何PHMG胁迫下变化，以及它们对甲烷产生和ARGs增殖影响未知。此外，厌氧微生物可能会随着反应时间在一定程度上适应特定的ECs，但目前尚不清楚长期暴露于PHMG是否会导致WAS中的微生物产生适应，从而导致甲烷的产生和ARGs的传播。

本研究旨在研究半连续WAS消化过程中PHMG对甲烷生成和ARGs扩散的影响及其机制。首先，阐述了PHMG对消化过程中CH₄生成和ARGs传播的影响。然后，研究了PHMG对胞外聚合物（EPS）分解和关键消化阶段的影响。进一步揭示了微生物群落结构的动态变化，重点阐述细菌和古菌之间的协同关系。最后阐明了半连续厌氧消化过程中PHMG干扰下代谢功能的响应及其适应机制。这项研究深入了解了厌氧消化过程中PHMG的环境影响行为，为WAS的安全处置提供了指导。

图文导读

PHMG对CH₄和ARGs的干扰效应

图1. PHMG对WAS消化过程中(A)甲烷产量、(B)ARGs和(C)典型ARGs丰度的影响

研究结果表明，PHMG的存在抑制了甲烷产生过程。值得注意的是，厌氧消化初期，低PHMG胁迫下的产甲烷活性低于对照组，但在32 d后有所恢复。相比之下，PHMG浓度较高的反应器表现出持续的抑制作用。这可能是由于PHMG对甲烷菌具有很强的毒性，甲烷菌对环境条件非常敏感。尽管PHMG的毒性抑制了WAS的厌氧消化过程，ARGs丰度却随着PHMG浓度的增加而增加，且以多肽类、MLS类、磺胺类和多药类为主，因此有必要评估其对环境和公共健康的潜在威胁。

PHMG对EPS分解及WAS厌氧消化关键阶段的影响

图2. (A)牛血清蛋白/葡聚糖与PHMG的分子对接，(B)蛋白质、(C)碳水化合物、(D) NH₄⁺-N、(E) PO₄^3--P及(F) VFAs的浓度变化

PHMG重塑微生物群落结构

图3.细菌和古菌在(A)门和(B)属水平上的相对丰度（%），(C)网络分析

微生物群落分析表明，系统中的优势门包括变形菌门（52.9-62.5%）、放线菌门（17.1-24.1%）、厚壁菌门（4.6-6.3%）、硝基螺旋藻门（3.3-5.0%）、拟杆菌门（1.8-3.2%）、氯霉素门（2.2-7.7%）和广古菌门（0.8-1.7%）。属水平的群落组成也表现出类似的趋势。例如，有助于VFAs产生的拟杆菌在PHMG反应器中增加了1.3-1.7倍。随着厌氧消化的进行，与碳水化合物和蛋白质等碳源分解相关的Haliangium的相对丰度在低PHMG反应器中下降，而在高PHMG反应器中增加，与VFAs的产生一致。同时，古菌的相对丰度受到不同程度的抑制，表明VFAs转化为CH₄的过程受到不利影响。具体而言，在PHMG反应器中，Methanolinea（氢营养型产甲烷菌）和Methanobrebacter（乙酸型产甲烷菌）的相对丰度均低于对照组，这与实际产甲烷量一致。利用二氧化碳和氢气产生甲烷的典型种间电子转移产甲烷菌Methanobacterium的相对丰度也有所下降。此外，一些与VFAs和甲烷生产相关的微生物也被认为是ARGs和MGEs的宿主。链霉菌作为抗生素的主要生产者和ARGs的关键宿主，在PHMG反应器中增加，这也是导致ARGs增殖传播加强的原因之一。

PHMG破坏细菌和古菌间的相互作用

图4.细菌-古菌相互作用的跨域生态网络分析（IDEN）

为了探究PHMG影响下细菌-古菌共生网络内的相互作用进行了IDEN分析。网络拓扑指标显示，PHMG反应器内的节点总数和连锁密度均低于对照组。这说明在对照反应器中，细菌与古菌之间的相互作用比在PHMG胁迫下更为复杂和紧密。在第16天，与对照组相比，PHMG反应器显示出更高比例的负相关链接，这表明在PHMG暴露下细菌和古菌之间的拮抗关系增加。然而，到40 d时，低PHMG反应器显示出正相关性的增加，反映了细菌和古菌之间拮抗作用的减少和物质交换的增强。值得注意的是，与古菌相比，细菌在网络结构中占主导地位，这表明PHMG的破坏削弱了细菌-古菌的相关性，导致资源分配的变化，使细菌在空间和时间上都占据优势生态位。此外，细菌和古菌之间的种间电子转移（IET）代表了一种物质转化和能量代谢途径和调节机制。这一过程作为细菌-古菌相互作用的一个关键方面，也被PHMG抑制。总体而言，PHMG削弱了细菌与古菌之间的共生关系，使细菌在生态位中占据主导地位。

PHMG诱导的微生物代谢和适应能力的变化

图5. PHMG暴露下WAS消化过程中甲烷生成和ARGs传播相关功能基因丰度变化

  微生物依靠复杂的信号系统来适应内部和外部环境的变化，这对它们的生存至关重要。PHMG显著上调了响应各种刺激并促进ARGs传播的双组分系统（TCS，包括pepD、mdtA、mtrA和isk）、细菌分泌系统（BSS，包括yscV、ftsY、secDF和secG）和群体感应系统（QS，包括agrC、oppA、oppC和ACSL）。PHMG暴露激活了微生物适应机制，但它进一步加剧了ARGs繁殖的风险，这与本研究中观察到的ARGs增加一致。由于QS、TCS和BCS的激活，参与底物利用和VFAs生物合成的基因在PHMG胁迫下显著上调。同时，PHMG显著削弱了甲烷代谢过程，但古菌在低PHMG条件下表现出适应性，在后期表现出较强的产甲烷能力。此外，与16 d相比，40 d时，编码古菌趋化性的cheA的相对丰度在低PHMG反应器中增加。然而，当PHMG浓度超过古菌的恢复耐受阈值时，这种抗性减弱。因此，虽然低PHMG刺激了古菌活性的恢复，但不足以抵消PHMG的负面影响。

PHMG对半连续流WAS厌氧消化的影响

图6. (A) RDA及(B) PLS-PM分析