“格致博雅”推荐阅读【遗传育种】|| 驴FBXL蛋白家族的氨基酸特征分析

中国拥有丰富的毛驴品种，总数超过30 种，其中24 种已被列入 《中国畜禽遗传资源志·马驴驼志》 [1]。2021 年在第七届中国驴业发展大会暨第二届德州驴种质资源保护与开发利用高峰论坛上李凤学[2]指出：尽管驴肉馆通过屠宰毛驴能够获得利润，大约在2500～3000 元，但养驴场面临平均每头驴3345.73 元的亏损。这一现象表明，尽管市场需求的增加使得驴产品价格不断上涨，从而为屠宰和销售驴肉的餐馆带来利润，但养殖环节却面临着挑战。驴作为传统的役用和乘骑动物，其繁殖能力对于个体和种群的发展与维持至关重要。然而，驴的繁殖发情周期受到气候条件、饲养管理、营养状况、年龄以及健康状况等多种因素的调控和影响，这些因素的复杂性导致了在驴繁殖领域仍存在许多待研究的问题。因此，尽管驴肉馆能够从驴肉销售中获利，但养驴场需要通过科学研究和技术创新来提高繁殖效率和降低成本，以减少亏损并确保驴产业的可持续发展。

FBXL 家族作为E3 泛素连接酶的组成部分，参与了细胞蛋白的降解过程，对细胞周期进程、转录和细胞凋亡等关键细胞过程发挥调节作用[3]。泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system，UPS）在真核细胞中发挥着高度调控和选择的作用，控制蛋白质的降解过程。UPS 指定蛋白质通过共价结合76 个氨基酸的泛素肽被降解，这一过程涉及到的蛋白质被标记为需要破坏的分子，随后将其引导到26S 蛋白酶体进行降解[4]。在这个过程中，泛素化的蛋白质被裂解成短多肽和氨基酸，这些成分随后在细胞中被分解或重复使用[5]。为了将泛素添加到目标蛋白质上，需要泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素连接酶（Ubiquitin ligase，E3）的协同作用，这些酶在一个明确的ATP 依赖级联中发挥作用，确保泛素化过程的精确性和高效性[6]。UPS在调节蛋白质稳态、转录调控、DNA 修复、细胞周期调节和抗原处理等方面都发挥着至关重要的作用。在骨骼肌发育和繁殖中，UPS 也具有重要的功能。此外，UPS 通过不同的E3 连接酶对目标蛋白进行泛素化后选择性降解。除了在蛋白质降解中发挥作用，增加特异性E3 连接酶已被发现在肌肉再生中发挥重要作用[7]。

FBXL 家族蛋白可能通过影响特定蛋白质的稳定性和功能，进而影响繁殖相关基因的表达和调控。例如，FBXL7 能够调节多种底物蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体的降解，这些底物包括Aurora A、Survivin、c-SRC、Snail1、TACC2、RhoA 和Dachs 等，它们在细胞周期、细胞迁移、侵袭、转移、代谢以及DNA 损伤等生物过程中起关键作用[8]。FBXL 家族基因的表达可能受到DNA 甲基化等表观遗传修饰的调控，这种调控可能影响相关基因在生殖组织中的表达模式，进而影响繁殖过程[8]。

目前，驴的FBXL 蛋白家族鲜有人研究，因此，本研究通过梳理FBXL 蛋白家族18 个成员，对其进行氨基酸特征分析，为探讨FBXL 家族参与的泛素化蛋白降解途径及其在动物繁殖和发育中的生物学功能提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 驴FBXL 蛋白家族氨基酸序列获取

利用在线网站NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取驴FBXL 蛋白家族的氨基酸序列。将获取的氨基酸序列输入下方各自对应的网站中，得到所需的各种蛋白的理化性质（不稳定系数、半衰期和稳定情况）、酶切位点、初级结构以及三级结构。

1.2 寻找驴FBXL 蛋白家族的结构域

利用在线数据库InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）对 驴FBXL 蛋白家族已知的结构域进行比对分析。

1.3 驴FBXL 家族编码氨基酸理化特性分析

利用在线数据库Expasy（https:/web.expasy.org/protparam/）对驴FBXL 蛋白家族的理化性质进行分析。不稳定系数是作为蛋白质在体外测试中稳定性的参考值，当不稳定系数小于40 时，提示蛋白质稳定性较好；大于40 时，蛋白质可能不稳定。

1.4 驴FBXL 蛋白家族酶解位点的预测

利用在线数据库Expasy（https://www.expasy.org/resources/peptidecutter）对驴FBXL 蛋白家族的酶解位点进行预测。

1.5 驴FBXL 家族编码跨膜区域和片段分析

利用在线数据库TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）寻找驴FBXL 家族编码跨膜区域和片段。

1.6 驴FBXL 蛋白家族的亚细胞定位预测

利用在线软件PSORT II prediction（https://www.genscript.com/psort.html）可对蛋白进行亚细胞定位预测分析获得家族成员的亚细胞结构定位及分布的百分比例。

1.7 驴FBXL 家族的蛋白互作分析

利用在线数据库STRING（https://cn.stringdb.org）构建与驴FBXL 蛋白相互作用的蛋白质网络。

2 结果与分析

2.1 驴FBXL 蛋白家族的结构域

利用在线数据库InterProScan 寻找驴FBXL蛋白家族的结构域，FBXL 家族的LRR 域在蛋白质降解过程中起着至关重要的作用，它们确保了特定底物蛋白的精确识别和随后的泛素化，是细胞内蛋白质质量控制和信号传导过程的关键环节[9]。结果如表1 所示。

表1 FBXL 蛋白家族结构域预测结果
Table 1 Structural domain prediction results of FBXL family proteins

2.2 驴FBXL 家族编码氨基酸理化特性分析

经ExPASy 网站中的ProtParam 工具，分析氨基酸序列的理化性质显示：根据氨基酸序列分析，不稳定系数、半衰期和稳定情况，所有蛋白的半衰期均为30，且只有FBXL7 蛋白稳定，其他蛋白家族均为不稳定（表2）。

表2 FBXL 蛋白家族的理化性质分析
Table 2 Analysis of physicochemical properties of FBXL protein family

2.3 驴FBXL 蛋白家族酶解位点分析

利用在线数据库Expasy 对驴FBXL 蛋白家族的酶解位点进行预测，经统计发现，18 个蛋白家族，含有37 个共同的酶切位点：Arg-C 蛋白酶、Asp-N 内肽酶、Asp-N 内肽酶 +n 端 Glu、BNPS-Skatole、Caspase1、Caspase2、Caspase3、Caspase4、Caspase5、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9、Caspase10、chymotrypsin -高特异性(C-term 至[FYW]，未在P 之前)、chymotrypsin-低特异性(C-term 至[FYWML])、未在P之前)、Clostripain、CNBr、肠激酶、GranzymeB、Xa 因子、甲酸、谷氨酰基内肽酶、羟胺、碘苯甲酸、LysC、LysN、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸、胃蛋白酶（pH 值=1.3）、胃蛋白酶（pH 值>2）、脯氨酸内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、烟草刻毒病毒蛋白酶、热溶酶、凝血酶、胰蛋白酶。FBXL 家族成员的酶切降解和不稳定性可能跟这些酶切位点有关。

2.4 驴FBXL 家族编码跨膜区域和片段预测

利用在线数据库TMHMM 寻找驴FBXL 家族编码跨膜区域和片段，预测分析表明18 个家族成员全部无跨膜结构域，据此判断其均为非分泌蛋白或通道蛋白。

2.5 驴FBXL 蛋白家族的亚细胞定位分析

利用在线软件PSORT II prediction 对蛋白进行亚细胞定位预测分析获得家族成员的亚细胞结构定位及分布的百分比例。根据其在细胞核、细胞质及细胞器中的分布比例分析判断，FBXL8、FBXL15、FBXL16 定位在细胞质，FBXL2、FBXL4、FBXL5、FBXL7、FBXL14、FBXL17、FBXL18、FBXL19、FBXL20、FBXL22 定位在细胞核中，FBXL3、FBXL6、FBXL 12、FBXL13、FBXL21 定位在线粒体中，表明FBXL 家族成员发挥功能的位置会有所不同。

2.6 驴FBXL 蛋白家族互作分析

运用STRING 数据库构建与驴FBXL3、FBXL21 蛋白相互作用的蛋白质网络。由图1 可知，与FBXL3、FBXL21 蛋白相互作用的蛋白质主要为SKP1、FBXL13、CRY1、CRY2、PER1、PER2 等相关蛋白质。

图1 FBXL3、FBXL21 蛋白的互作网络
Fig.1 Interaction network of FBXL3、FBXL21

3 讨论

钟英杰等[10]研究发现，在苏尼特羊的季节性繁殖周期中，当从短日照的发情期过渡到长日照的休情期时，FBXL3 基因的表达量上升，而FBXL21 基因的表达量下降，这表明FBXL3 和FBXL21 可能在季节性繁殖行为的上游调控机制中起着关键作用，它们可能通过与下丘脑的核心生物钟系统相互作用来发挥影响。Dardente 等 [11]研究发现，FBXL3 和FBXL21 基因在绵羊中呈现昼夜节律周期性表达。本研究对FBXL3 蛋白和FBXL21 蛋白进行蛋白互作分析发现驴FBXL3 和FBXL21 蛋白与多个节律钟基因互作，故猜测FBXL3 和FBXL21 可能影响季节性发情，具体其发情机制还需进一步研究。基于此，推测FBXL3和FBXL21 可能在季节性繁殖行为中起着调控作用，但关于它们具体的调控机制，仍需通过进一步的研究来阐明。

杨阳等[12]研究发现，通过生物信息学发现FBXL3 蛋白的若干特定突变位置上的氨基酸失去了被磷酸化的属性。磷酸化是一种对蛋白质功能至关重要的后合成修饰方式，它对蛋白质的活性及其在生物过程中的作用有着显著的调节作用[13]。袁曼曼[14]在京海黄鸡FBXL5 基因的外显子上测出4 个SNP 位点，形成8 种单倍型，在繁殖性状方面，各单倍型组合之间存在显著差异或极显著差异，说明突变位点对生长、繁殖性状有显著影响或极显著影响。本研究通过对FBXL5 蛋白结构域预测发现其含有一个特殊结构域：Skp1 binding site。杨阳等[12]研究发现，绵羊FBXL3 基因g.52551820G>A 位点发生突变，故猜测突变为A 的这一位点极有可能跟绵羊的季节发情有关。

目前，尚未见有关FBXL 基因家族在驴中的作用的相关报道。然而，基于绵羊等其他动物的研究，该基因家族很可能在驴的繁殖周期中也发挥作用。下丘脑的视交叉上核是核心生物钟的所在位置，它通过神经途径向松果体发送信号，进而影响褪黑激素的产生。褪黑激素进一步作用于下丘脑-垂体-性腺轴（HPGA），对季节性繁殖行为进行调节。在季节性繁殖的动物中，这一调控过程尤为关键，它对繁殖周期的启动和维持起着至关重要的作用[15,16]。节律钟基因的功能障碍会干扰生物钟的正常工作，最终可能导致哺乳动物的发情和排卵过程受阻[17-19]。在本研究中，通过分析蛋白质相互作用网络，发现FBXL3、FBXL13、FBXL21 等蛋白与节律钟基因CRY1、CRY2、PER1、PER2 存在关联[20]，表明这4 个基因可能在驴的繁殖周期调控中扮演重要角色，为进一步研究驴FBXL3、FBXL13、FBXL21 等基因在繁殖发情周期调控方面奠定基础。

4 结论

本研究对驴FBXL 家族18 个成员进行蛋白质的理化性质、酶解位点、初级结构和三级结构分析，发现泛素化因子参与性腺轴关键蛋白降解和节律性调控，进而调节驴的繁殖发情周期。

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