VlnPlot结果及常用参数浅析

单细胞分析中小提琴图用途

小提琴图是一种在单细胞RNA测序数据分析中常用的可视化工具，它能够展示数据分布的密度估计，并且可以用于比较多个群组的基因表达水平。

比如在单细胞分析中，在进行质控前，会使用小提琴图可视化nFeature_RNA, nCount_RNA, percent.mt，辅助我们选择合适的阈值进行质控

# Visualize QC metrics as a violin plot
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

在可视化Marker基因的时候，VlnPlot也是非常常用的一种方法！

之前的推文有详细整理过ncount_RNA 和nFeature_RNA辅助过滤,那这期我们一起来学习了解一下VlnPlot小提琴图可视化marker基因！

VlnPlot可视化辅助质控

虽然之前的推文有详细整理过ncount_RNA 和nFeature_RNA辅助过滤，但是好像仅仅只介绍了一下数据以及阈值选择，没有介绍一下小提琴图的结果，所以补充一下

在小提琴图结果解析：

• 在小提琴图中，x轴代表不同的样本或细胞群组，y轴代表数值（如基因表达水平）。每个“小提琴”描述了一个群组中数值的分布情况。
• 中间较宽的部分表示数据点比较集中的区域，即大多数细胞的基因数量或RNA分子总数落在这个范围内。
• 两端较细的部分表示数据点较少的区域，即较少的细胞具有这些数值。
• 通过观察小提琴图的形状和分布，可以直观地看出数据的集中趋势、离散程度和潜在的异常值。

VlnPlot可视化marker基因

使用到的还是PBMC3k的数据，走完降维聚类分群之后，使用FindAllMarkers计算所有簇的Marker基因

#计算所有簇的Marker基因，并且可视化TOP5基因
# only.pos = TRUE，只关注上调；min.pct = 0.25，一个基因至少要在25%的细胞中表达
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25,  logfc.threshold = 0.25, verbose = FALSE)
top5 = pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 5, wt = avg_log2FC)
g = unique(top5$gene)

可视化结果浅析

首先选择一个基因进行可视化展示，并且将结果数据保存为一个变量，进行查看

p1 = VlnPlot(pbmc, features = "MS4A1")
p1

• 在小提琴图中，x轴代表不同的样本或细胞群组，y轴代表基因表达水平。通过观察各个群组的小提琴图形状和位置，可以了解MS4A1在不同细胞群组中的表达分布。
• 小提琴图中的宽度代表了各个表达水平的细胞数量。较宽的部分表示该表达水平的细胞较多，较窄或不存在的部分表示较少或没有细胞具有该表达水平。。
• 小提琴图的轮廓显示了数据的概率密度，而图中的点则代表细胞表达的数量，这些点有助于直观地看到数据的分布。
• 由图可得MS4A1基因在B细胞群组中表达量较高，而在其他细胞群组中表达量较低或不表达。

绘图数据概要

> class(p1)
[1] "patchwork" "gg"        "ggplot" 

通过class查看结果数据的类型，其中"patchwork"表示p1是一个经过patchwork处理的复合图形，而"gg"和"ggplot"表示它是基于ggplot2创建的图形对象。

• 数据（data）：
• 一个包含2638行和2列的数据框架（data.frame）。用于生成小提琴图的数据集，其中每一行代表一个细胞。
• 可以通过View(p1[[1]][["data"]])查看，基于表达量排序之后可以看到是在B细胞中高表达

• 图层（layers）：

• 表示构成图形的图层。在ggplot2中，图层可以包括几何对象（如点、线、面等），统计变换，数据映射等。

• 比例（scales）：

• 定义了图形的比例尺，例如x轴和y轴的取值范围和断点。

• 导向（guides）：

• 表示图形的辅助元素，如图例、颜色条等。

• 映射（mapping）：

• 定义了数据如何映射到图形的美学属性上，例如颜色、形状、大小等。

• 主题（theme）：

• 定义了图形的外观和风格，如字体、背景色、轴线等。

• 坐标（coordinates）：

• 表示图形使用的坐标系统，例如笛卡尔坐标、极坐标等。

• 分面（facet）：

• 表示图形是否使用了分面，分面可以将数据的子集并排或堆叠显示。

• 环境（environment）：

• 存储了图形的计算环境，可能包含用于计算图形的变量和函数。

• 标签（labels）：

• 可能包含图形的标签信息，例如轴标题、图例标题等。

常用参数

除了导入结果数据的object以及需要绘制的features基因集，还可以修改颜色和点的大小和透明度：

• cols：用于绘制不同类别的小提琴图的颜色。

• pt.size：图中代表单个细胞数据点的大小。

• alpha：数据点的透明度。

选择需要展示的细胞群组以及分组信息：

• idents：指定要在图中包括哪些细胞群组（例如，细胞类型）。默认情况下，包括所有群组。

• sort：根据被绘制属性的平均表达量对身份类别（x轴上）进行排序。你也可以传递'increasing'或'decreasing'来改变排序方向。

• group.by：根据对象元数据中的不同方式对细胞进行分组（例如，orig.ident）。

• split.by：对象元数据中的一个因子，用于分割图表。传递'ident'可以按细胞身份分割。

• adjust：geom_violin的调整参数，用于调整小提琴图的形状。

选择用于可视化的数据——原始counts矩阵或者标准化后的data数据：

• slot：从哪个槽中提取表达数据（例如 "counts" 或 "data"）。

• layer：从哪个层中提取表达数据（例如 "counts" 或 "data"）。

• log：是否对特征轴（通常是x轴）使用对数刻度。

默认是选择data数据进行可视化的，当需要选择counts矩阵进行可视化时，可以使用slot参数进行指定

#默认data数据可视化结果
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"))

#使用counts绘图
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

结果图美化的可选参数：

• ncol：如果显示多个图表，设置列的数量。

• split.plot：控制是为分割的每个组绘制多个还是单个小提琴形状。

• stack：是否水平堆叠每个特征的图表。

• combine：是否将图表组合成一个单一的patchworked ggplot对象。如果为FALSE，则返回一个ggplot列表。

• fill.by：根据'feature'或'ident'对小提琴图进行着色。

• flip：翻转图表方向（身份类别在x轴上）。

这些参数允许基于需求去自定义小提琴图的外观和展示方式，下期我们就具体来看看如何基于这些参数得到更加好看的小提琴图！