何玙冰，付振浩，李仁瀚，刘秀霞，刘春立，杨艳坤，李业，白仲虎
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0225
2-萘乙醇（2-Naphthaleneethanol）是一种萘的衍生物，常用作有机合成中间体，主要用于制备各种萘类化合物。目前制备2-萘乙醇的方法全部是化学合成，化学制备2-萘乙醇的过程中需要大量的能源和原材料，同时会产生大量污染物和废弃物。微生物易培养、可改造性强，生物培养绿色环保、生产成本低，可以通过探索相关代谢途径实现2-萘乙醇的生物合成。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 推测2-萘乙醇在酿酒酵母中的合成途径并验证
2.2 绘制生长曲线
2.3 探究不同浓度的2-萘丙氨酸对细胞生长和2-萘乙醇产量的影响
2.4 过表达Ehrlich途径相关基因
3 讨论
4 结论
2-萘乙醇是一种重要的有机合成中间体，目前其合成仍以化学合成为主。化学制备2-萘乙醇需要消耗大量的能源和原材料，同时会产生大量污染物和废弃物，因此开发合适的生物合成方法具有较大的理论和应用意义。可以通过探索相关代谢途径实现2-萘乙醇的生物合成，而芳香族氨基酸代谢途径Ehrlich途径是生物合成2-萘乙醇的潜在途径之一。
目前国内外对于Ehrlich途径的研究主要集中在几种天然氨基酸，但是对生物合成一些不常见的非天然氨基酸及其衍生物的研究较少。Ehrlich途径第一步反应的两个酶：双功能2-氨基己二酸转氨酶Aro8p和芳香族氨基酸2-酮戊二酸转氨酶Aro9p能够催化与芳香族氨基酸代谢相关的绝大部分转氨反应，而2-萘丙氨酸的结构与常见的天然芳香族氨基酸相似，故推测2-萘丙氨酸也可以被酿酒酵母利用，进入Ehrlich途径并生成2萘乙醇。本研究向酿酒酵母发酵液中外源添加2-萘丙氨酸，实验组发酵上清液样品在液相中的出峰时间可以与标品相匹配，而未添加2-萘丙氨酸的对照组和未接种BY4741的空白组均未出现2-萘乙醇的吸收峰，证明2-萘丙氨酸可以被酿酒酵母利用生成2萘乙醇，从而实现了2-萘乙醇的生物合成。
实验中种子液为普通的SC培养基，底物是在发酵液中添加。更换培养基后，菌株的生长特性可能有所改变，因此探究菌株随时间的生长和生产情况以及不同浓度底物对菌株的影响对发酵过程具有指导性意义。实验表明，菌株BY4741在添加底物后生长略差一些，但生长周期没有发生改变。在不同浓度2-萘丙氨酸发酵液中，菌株生长无明显区别，但转化率呈先上升后下降的趋势，因此推测进入细胞的底物有限，Ehrlich途径的反应速率有限。
因野生型酿酒酵母BY4741转化2-萘丙氨酸为2-萘乙醇的转化率仅为15%左右，为提高2-萘乙醇产量，对BY4741进行了代谢工程改造，并进行了发酵实验。过表达转氨酶基因和脱羧酶基因后，相较于野生型，2-萘乙醇的产量均有一定的提高，再次证明2-萘丙氨酸是进入Ehrlich途径合成2-萘乙醇，而非其他途径。
本研究虽然将Ehrlich途径的底物进行了扩展，但一些其他有潜在研究价值的芳香族氨基酸以及它们的衍生物仍有很大研究空间，如羟基酪醇。代谢工程方面，通过代谢改造等方法打通从头合成的代谢通路会使成本更低；抑制催化可逆反应的醇脱氢酶的活性以减少产物的再度消耗或敲除竞争途径以减少副产物也是日后的研究方向；于Ehrlich途径涉及到的酶众多，可能仍有其他的基因组合更适合生产2-萘乙醇，不过应确定途径酶表达的适当水平，以防止过度工程化途径造成不必要的代谢负担以及下游生物合成所需前体供应不足等问题；还可以引入动态调控机制，减少反馈抑制，提高转化率。发酵优化方面，可选择更换合适的碳源，如木糖、纤维素等，更换碳源也有助于提高Ehrlich途径的效率。近年来，为减少代谢工程的工作量，不少研究者将代谢工程与计算机模拟相结合，根据模式生物的代谢模型，确定敲除或过表达的基因也是日后的研究方向之一。
本研究以酿酒酵母为底盘细胞，通过外源添加2萘丙氨酸进入Ehrlich途径，实现了生物合成2-萘乙醇。对野生型酿酒酵母BY4741进行了代谢工程改造，分步过表达了Ehrlich途径的6个基因，探索出了利于2-萘乙醇生物合成的基因组合，为工业生产2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法。
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