《细胞》：西湖实验室邹贻龙/王曦团队合作揭示不饱和脂质代谢通路对肿瘤转移的多重作用

图1. 研究揭示不饱和脂质代谢网络在肿瘤转移的血运扩散和远端器官定植生长等环节中发挥的双重作用。

近年来，癌症靶向疗法、免疫疗法等治疗手段的突破为众多的癌症患者带来了福音，但肿瘤的广泛远端转移仍是困扰癌症治疗的焦点问题。不同类型的原发瘤在转移路径、目标器官、生长时程和药物反应上存在差异，这使得系统性寻找肿瘤转移过程中的薄弱环节和有效药物靶点面临巨大挑战。以卵巢癌为例，除了高频的原发瘤发生率外，该癌种至少可以通过三种不同的转移路径：腹水转移、血运转移和淋巴转移实现对远端器官和组织的侵袭。不同路径的转移效率和范围差异显著（图2）。这种“多管齐下”的转移方式给卵巢癌的有效治疗带来了极大障碍，也是患者生命的最大威胁。尽管不难预见卵巢癌的多种转移路径对癌细胞的分子与细胞生物学特征会提出不同的要求，但高效的癌症转移动物模型的缺失使科研人员难以将这一问题具体化并开展系统性机制研究。

图2. 临床上卵巢癌患者中肿瘤实现远端转移的三种主要扩散路径。

首先，为了寻找高转移能力的癌细胞的弱点，本研究通过大数据挖掘，发现肿瘤细胞的远端转移能力可能与多种化合物的敏感性相关。特别突出的化合物包括细胞铁死亡诱导剂，如GPX4抑制剂ML210、RSL3、ML162和SLC7A11抑制剂Erastin（参见Zou Y et al. 2019 Nature Communications）。从卵巢癌患者的原发灶、腹水和转移瘤中分离的原代细胞证实了这一特征。进一步的脂质组学分析显示，转移瘤细胞含有更高水平的多不饱和脂质。这类脂质是亚铁离子催化下膜脂质过氧化的主要底物，也是细胞对铁死亡诱导剂敏感性的主要驱动因素（参见BioArt前期报道: 2020 邹贻龙等：揭示细胞获得铁死亡敏感性与逃逸死亡的分子机制）。这一现象表明，肿瘤细胞的脂质组成可能直接调控其转移能力（图3）。

图3. (A) 散点图展示了按谱系分组的MetMap癌症细胞系转移能力与CTRPv2化合物敏感性之间的相关性。(B) 散点图展示了来自配对的卵巢癌患者原发瘤，腹水，大网膜转移瘤来源的原代细胞对RSL-3化合物的IC50值。(C) 堆叠条形图展示了原代肿瘤细胞脂质组学分析中各脂质类别内特异性脂质的相对强度。脂质按照脂肪酰侧链中的最大不饱和度进行分组。

为了揭示脂质组成和代谢因素对卵巢癌转移模式和效率的调控作用，研究人员选用了一株经此前验证具有极高转移能力和铁死亡敏感性的人卵巢癌细胞系ES-2，属透明细胞癌亚型，进行了多轮体内筛选，以富集和遴选具有多路径转移潜能的癌细胞克隆。最终，获得了具有极强转移能力的亚细胞系ES-2-MC2-Lung和ES-2-MC2-Hep。基于ES-2-MC2-Hep在腹腔内高效生长及远端多脏器转移的能力，研究人员利用靶向代谢酶的CRISPR sgRNA文库进行了系统性地体内遗传筛选，定义了多个可能介导不同器官转移的代谢酶基因。根据筛选结果，进一步的体内遗传学与功能学实验验证了NMNAT1，其中一个靶标基因，是卵巢癌肝脏和肺脏转移的依赖性基因，提示其在卵巢癌腹腔转移和血运转移中的重要作用。

值得注意的是，ACSL4，编码激活和调控不饱和脂肪酸代谢的酶，是肺特异性转移中的关键基因。ACSL4特异性催化不饱和脂肪酸转化为脂酰辅酶A，参与不饱和磷脂的合成及脂肪酸的氧化，支持细胞的高膜流动性和生物能量供应。近年来，ACSL4因为其在调节细胞对化合物诱导的铁死亡敏感性中的显著作用而受到广泛关注。在本研究中，研究人员进一步探讨了ACSL4调控肿瘤细胞肺转移的机制，发现ACSL4显著增强了卵巢癌细胞的膜流动性和迁移能力，促进癌细胞的血管外渗，帮助肿瘤细胞在肺实质中更好地定植。研究人员还在肝癌肺转移模型中验证了ACSL4的促癌细胞血管外渗作用，提示其在其他癌症转移过程中的功能普适性（图4，图5）。

图4. (A) 示意图总结了ES-2远端转移衍生细胞系的体内迭代筛选过程，以及衍生的ES-2-MC2-Hep细胞系肝脏和肺脏转移的代表性BLI图像。(B) 示意图总结了通过腹腔注射ES-2-MC2-Hep细胞所建立的卵巢癌腹腔转移和血运转移过程。(C) 示意图展示了使用靶向代谢酶的sgRNA文库进行体内CRISPR筛选以鉴定ES-2-MC2-Hep转移模型中远端转移调控因子的过程。(D) 化学示意图描述了ACSL4的催化活性。PUFA, 多不饱和脂肪酸。(E) 尾静脉移植所示细胞系后小鼠体内BLI成像分析的代表性伪彩图和相对光子数的定量分析。

图5. (A) 尾静脉注射所示细胞系后，小鼠肺部切片代表性的免疫荧光图像。(B) 堆叠条形图展示了小鼠尾静脉注射所示细胞系后，肺切片中不同形态转移灶的计数。(C) 体内肿瘤外渗实验中，小鼠肺部BLI成像分析的代表性伪彩图像。(D) 图C的BLI成像分析中相对光子数的定量分析。(E) 表达所示sgRNA的ES-2-MC2-Hep细胞的膜流动性分析。(F) 表达所示sgRNA的ES-2-MC2-Hep细胞的迁移能力分析。

尽管ACSL4的敲除会抑制肿瘤细胞转移过程中的血管外渗步骤，但研究人员注意到，由于实验所用的转移模型的高度侵袭性，抑制ACSL4最终很难彻底控制肿瘤细胞的整体转移负担。一种可能的解释是，ACSL4在转移的前期定植阶段是必需的，而在后期转移灶的显性生长阶段则可能不再被需要。为了探索抑制具有高不饱和脂质含量以及高转移潜能肿瘤细胞体内生存和生长的替代策略，研究人员根据CRISRP遗传筛选的结果重新比较分析了移植后肿瘤和移植前肿瘤细胞中的sgRNA丰度，揭示并验证了由ECI1和ECH1等基因介导的不饱和脂肪酸β-氧化通路在调控肿瘤体内生长过程中的重要作用 （图6）。

图6. (A-C) 火山图展示了通过比较体内各个位置和脏器生长的肿瘤与注射前肿瘤细胞的sgRNA丰度，鉴定对肿瘤体内生长有贡献的基因。(D) ECI1和ECH1调控的不饱和脂肪酸β-氧化途径的化学反应示意图。(E) 皮下移植表达所示sgRNA的ES-2-MC2-Hep细胞系后，皮下肿瘤的生长曲线图。(F) 皮下移植表达所示sgRNA的ES-2-MC2-Hep细胞系后，皮下肿瘤相对重量的箱线图。

这里值得注意的是，饱和脂肪酸例如棕榈酸(C16:0)在经过活化之后通常可以直接通过线粒体中的β-氧化通路产生乙酰辅酶A和截短两个碳的脂酰分子, 并通过此反应的循环而逐步被降解。然而，不饱和脂肪酸由于C=C双键的存在，β-氧化会在进行到靠近双键时被阻断，进而需要通过相应的异构酶、水合酶和脱氢酶来实现对双键的移位，确保β-氧化能够继续进行。本次筛选中所获得的ECI1和ECH1等代谢酶正是这一特征反应中的关键催化酶。

研究人员发现的具有高转移能力的肿瘤细胞在体内生长过程中出现对不饱和脂肪酸β-氧化通路的特征性依赖，似乎在提示这些肿瘤细胞虽然因为富集多不饱和脂质而在跨血管外渗和广泛扩散中获得了一些优势，但同时也因为其在转移之后仍然继承了这种富含不饱和脂质的脂型(lipotype), 而更主动的使用富余的不饱和脂质作为营养物质。这一适应性的代谢程序选择给通过抑制ECI1/ECH1的活性来克制转移瘤爆发创造了机会。

鉴于不饱和脂肪酸代谢在肿瘤细胞血管外渗和体内生长过程中的双重作用，研究人员在多种肿瘤转移模型中联合敲除了ACSL4和ECH1的表达，同时抑制了肿瘤细胞在远端器官的定植和生长，成功控制了肿瘤细胞整体的血运转移负担 （图7）。

图7. (A) 示意图展示了不饱和脂肪酸代谢在肿瘤转移外渗和定植过程中可能的双重作用。(B) 蛋白免疫印迹显示了表达所示sgRNA的ES-2-MC2-Hep细胞中ACSL4和ECH1的蛋白表达水平。(C-D) 尾静脉移植所示细胞系后小鼠肺部BLI成像分析的代表性伪彩图和相对光子数的定量分析。(E-F) 尾静脉移植所示细胞系后小鼠肺部代表性图片和肺部BLI成像相对光子数的定量分析。(G) 示意图展示了不饱和脂肪酸代谢在肿瘤转移外渗和定植过程中的双重作用。

这项研究的主要意义在于：

1）系统性地挖掘了肿瘤转移相关的化合物敏感性，并构建了转移瘤相关原代细胞培养体系和动物模型，为肿瘤转移的机制研究提供了资源和模型;

2）通过体内CRISPR功能基因组学筛选，揭示了多条在肿瘤多路径转移过程中发挥作用的代谢通路，提供了潜在的抗肿瘤转移靶点;

3）深入揭示了不饱和脂质代谢通路在肿瘤血运转移中的突出贡献，并发现这一作用在多个癌种中的可推广性，为透彻理解肿瘤转移的代谢调控机制提供了新的视角。本研究有望加速针对卵巢癌等多癌种的转移过程的新型药物开发。

本研究受到国家科技部重点研发计划、国家自然科学基金面上项目、浙江省“尖兵”&“领雁”项目、西湖实验室、西湖大学未来产业研究中心和西湖大学教育基金会提供的经费支持。同时，本文感谢西湖大学生物医学实验技术中心提供的多项技术支持。

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相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.047

编辑 | 余   荷

排版 | 王大雪

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