别以为科研论文就不用讲故事了！哈医大一院只用公共数据+少量16s测序就能拿下二区sci，讲好故事工作量少一半！

文摘 2024-07-16 19:02 山东

各位宝子们大家好，这里暑假也坚持坐在实验室的船长。硬核的文章咱看多了，今天就来给大家带来一篇高性价比文章。

船长经常听到有同学吐槽，实验经费不够用怎么办，那当然是选择整合公共的测序数据分析呀，一来省去测序成本，二来增加数据量。而且单细胞测序数据较一般的转录组数据还是很有优势的，尤其有一定的技术和成本的门槛，所以还没有被大水漫灌，最后再来点湿实验验证，简直法力无边。跟上船长的脚步，点赞关注不迷路~这就带大家把这篇文章学起来~

1、多组学数据整合：文章结合单细胞转录组学、微生物组学和蛋白质组学数据，为胆结石病理机制提供了全面视图，同时还利用16S rRNA基因测序深入探讨了胆囊微生物群与胆结石的关联。

2、实验验证：作者利用免疫荧光和WB技术、动物模型构建、统计学分析等多种技术进行验证，加强了结果的可靠性。ps：总体来说，这篇文章的性价比还是很高的，测序用到的是16s，成本相对来说较低，再从公共数据库进行数据挖掘，最后进行湿实验验证，船长建议生信小白们不要错过，说不定你的毕业文章就指望这些技术啦~想要量身定制数据分析方案，欢迎来扫这个二维码滴滴船长哦。

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后台回复321获取原文献，文献编号20240716

题目：幽门螺杆菌CagA通过增加胆囊上皮细胞的通透性促进胆结石的形成

杂志：HELICOBACTER

影响因子：IF=4.3

发表时间：2024年06月

研究背景

胆结石形成的临床难题包括其多因素的成因、慢性炎症与结石形成的关系、幽门螺杆菌感染在胆结石形成中的作用，以及胆囊微生物群失调对疾病的影响。此外，作者还强调了对幽门螺杆菌CagA蛋白如何通过增加胆囊上皮细胞的通透性来促进胆结石形成的机制的进一步探索的必要性。当前治疗方法的局限性和对新预防策略的需求也是临床面临的挑战。

研究思路

作者通过收集和分析来自公共数据库的单细胞和组织转录组数据，结合16S rRNA测序和动物模型实验，探讨了幽门螺杆菌CagA蛋白如何通过增加胆囊上皮细胞的通透性来促进胆结石的形成，揭示了胆结石形成过程中胆囊微生物群失调和慢性炎症的潜在机制。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
GSE179524	GEO	单细胞测序	包括 1 份正常胆囊样本、1 份胆结石样本和 1 份含有牛磺熊去氧胆酸的胆结石样本
GSE202479	GEO	bulk RNA-seq	包括三个正常胆囊组织和四个胆囊，这些胆囊由GS组织诱导的慢性炎症
自测数据	自测	16s rRNA	从有症状 GS 的胆囊切除术患者中收集胆囊和胆汁样本，分为 GS 组（n = 6），从健康肝脏供体中收集胆囊样本并分为NC组（n = 6）

主要结果

1.胆结石小鼠模型胆囊的机械屏障损伤和炎症浸润

研究者利用GSE179524数据集，通过单细胞测序技术分析了胆结石小鼠模型胆囊中的细胞多样性和异质性。通过UMAP降维和FindCluster聚类，识别出7个不同的细胞簇（图1A），主要包含上皮细胞、内皮细胞和中性粒细胞（图1B，C）。特别是，中性粒细胞在胆结石组中显著增多（图1D）。KEGG分析揭示了与白细胞迁移和细胞间连接相关的途径在胆结石小鼠胆囊中的显著富集（图1E），指示了胆囊粘膜屏障损伤和炎症细胞浸润的存在。

图1 利用scRNA-Seq对胆囊结石进行剖析

2.胆结石小鼠胆囊上皮细胞渗透性增加，中性粒细胞显著活化

研究者通过对胆结石小鼠模型的上皮细胞和中性粒细胞进行亚群分析（图2A，B），发现了与白细胞迁移和细胞紧密连接相关的基因表达变化（图2C-E）。特别发现中性粒细胞的某些亚群在胆结石组中特别活跃（图2F，G），并与多种细胞死亡途径相关（图2I-K），包括与胆结石形成有关的NETosis。进一步的细胞间通讯分析揭示了上皮细胞与特定中性粒细胞亚群之间的显著相互作用（图2L，M），表明中性粒细胞可能通过形成NETs来促进胆结石的形成。

图2 胆结石小鼠模型：胆囊黏膜机械屏障，中性粒细胞活化

3.胆结石患者胆囊上皮细胞的持续损伤

研究者通过对胆结石患者和健康供体的胆囊及胆汁样本进行分析，发现胆结石患者的胆汁中甘油三酯和总胆固醇水平显著升高（图3A，B）。组织切片的HE染色显示胆结石患者的胆囊粘膜层不完整，上皮细胞排列疏松，暗示胆囊粘膜屏障可能受损。免疫组化和WB检测结果显示（图3C，D），胆结石患者组的紧密连接蛋白OCLN和TJP1表达低于对照组。这些发现指出胆结石可能导致胆囊上皮细胞的持续损伤。

图3 胆石症患者胆囊上皮细胞的持续损伤

4.胆囊微生物群紊乱和免疫渗透可能是胆石症患者形成胆结石的关键因素

研究者通过分析胆结石患者与对照组胆囊组织的基因表达差异，发现胆结石组有大量基因表达上调和下调（图4A，B）。利用GO和KEGG分析（图4C-F），发现胆结石患者胆囊中的基因在免疫效应过程、细胞连接等方面显著富集，暗示胆囊微生物群的破坏和免疫浸润可能与胆结石的形成有关。ESTIMATE算法分析进一步表明胆结石患者的胆囊免疫浸润水平显著升高。

图4 胆石症患者胆囊转录组测序分析

5.螺旋杆菌可能是导致胆囊机械屏障损伤的关键致病菌

通过对无症状胆石症患者和肝脏移植供者的胆囊粘膜样本进行16S rRNA测序分析，发现了两组之间在微生物组成上的显著差异。OTU聚类显示结石组和对照组之间有3724个共有的OTUs，结石组有2611个独特的OTUs，对照组有2087个（图5A）。PCoA显示了两组间胆囊粘膜细菌的显著差异（图5B）。基于Bray-Curtis差异性的Anosim分析也显示了两组间的显著差异（图5C）。研究者还评估了微生物群落的α多样性和β多样性，发现结石组的α多样性和β多样性显著高于对照组，表明结石组胆囊粘膜微生物群的相对丰度增加和物种多样性破坏（图5D,E）。在门水平上，结石组中Deinococcota、Verrucomicrobiota和Euryarchaeota显著增加，而Myxococcota、Gemmatimonadota和Acidobacteriota显著减少（图5F）。通过t检验和随机森林分析（图5G，H），研究者在属水平上鉴定出关键的致病菌，发现结石组中Helicobacter属显著增加，已知该属能够破坏胃粘膜屏障。基于这些发现，研究者推测Helicobacter属可能是导致胆囊机械屏障损伤的关键致病菌。

图5 胆石症患者胆囊粘膜组织的16s rRNA测序分析

6.CagA在胆囊炎小鼠模型中诱导机械屏障损伤

研究者通过免疫荧光（图6A）验证了胆结石患者胆囊粘膜中Helicobacter属细菌的定植，并通过WB和ELISA检测发现胆结石组CagA蛋白水平和胆汁中CagA含量显著升高（图6B，C）。利用CagA注射构建的小鼠胆囊结石模型进一步证实了CagA能够促进结石的形成和发展（图6E）。组织学检查（图6F）显示CagA处理导致胆囊粘膜损伤和上皮细胞的脱落与坏死，且CagA处理后紧密连接蛋白TJP1和OCLN的表达降低，表明Helicobacter属细菌通过CagA增加了胆囊粘膜的通透性。

图6 CagA介导的胆囊机械屏障损伤

文章小结

这篇文章综合运用了单细胞RNA测序、16S rRNA基因测序、免疫荧光染色、西方印迹、ELISA、动物模型构建和组织学检查等一系列技术方法，从分子到整体水平全面探究了胆结石的形成机制，重点研究了幽门螺杆菌及其CagA蛋白在胆囊粘膜屏障损伤和胆结石发展中的作用。文章最后通过统计分析和湿实验验证了实验结果的科学性和准确性，就这样完美的讲述了一个故事。想复现这个思路但不知道如何入手？想个性化设计生信创新思路？或是有进一步需求的小伙伴，欢迎来后台滴滴船长哦，这里有一大波高分文章套路可复现！

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