🧬 探秘T4连接酶：基因“分子缝合针” 🧬
文摘
科学
2024-05-21 17:58
江苏
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Yugong Biotech & BestEnzymes
在高中的生物课教材里，就告诉我们基因工程至少需要三种工具：“分子手术刀”、“分子缝合针”和“分子运输车”。之前我们已经了解了“分子手术刀”——限制性内切酶的前世今生，今天我们就来聊聊最常用的“分子缝合针”——T4 DNA连接酶。
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1967年，科学家们在侵染大肠杆菌的T4噬菌体中发现了一种酶，能够将断裂的双链DNA连接起来，于是命名为T4 DNA连接酶。后来发现T4连接酶不仅能够连接双链DNA，也能修复双链DNA、DNA-RNA杂合链上的切刻，就像是一套万能的缝合针。T4 DNA连接酶在缝合DNA时需要两端有能穿针的“搭扣”，即3'末端的自由羟基和5'末端的磷酸基团，同时还需要ATP参与提供能量。
因为要精确连接DNA末端，所以T4 DNA连接酶对纯度要求很高，微量其他核酸酶的污染就会破坏DNA末端导致连接失败。愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast) 经过精细纯化，纯度与进口产品相当，优于国内竞品。
T4 DNA聚合酶可以连接各种类型的双链DNA末端，无论是末端有突出 (overhang) 的粘性末端 (sticky end)，还是末端平齐的粘性末端 (blunt end)。对于不同类型的DNA末端，连接效率差异较大。一般而言，粘性末端的连接效率远高于平末端；对于粘性末端，4碱基突出的连接效率高于2碱基突出，但单碱基突出的粘性末端连接效率有时也接近平末端。根据我们的数据，3'突出末端的连接转化效率高于5'突出末端。此外，突出序列CG含量高的连接效率更高。
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T4 DNA连接酶的用量对于连接反应的效率有很大影响，但不同公司对T4 DNA连接酶的活性定义方式差别较大。在使用之前一定要仔细阅读产品说明书，确保所用的“缝合针”是适合实验需求的。
下表列出了愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast)和其他几种常见T4 DNA连接酶的活性定义和换算比例（根据各家说明书数据），供参考。
首先，T4 DNA连接酶比较“娇贵”，最适反应温度在22℃左右，很容易失活，取用时一定要注意冰上操作，取完后立即放回-20℃保存。此外，普通T4 DNA连接酶对Na+、K+等一价金属离子的耐受性也比较差。其次，T4 DNA连接酶的连接效率受到酶的用量、目的片段与载体浓度及摩尔比、载体大小、DNA纯度等因素的影响较大，需要仔细阅读说明书，并根据自己的实验调整。
第三，一定分子量的聚乙二醇 (PEG) 能极大提高平末端的连接效率，可根据连接反应体积的5%酌情添加。愚公&百时美T4 DNA Ligase (Fast)
反应快速（室温下10 min即可完成粘性末端连接）
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| 江苏愚公生物科技有限公司（简称“愚公生物”）致力于解决国内生物医药高端原料酶和工具酶“卡脖子”现状，为中国生物医学行业提供更多优质、经济、使用方便，且拥有自主知识产权的酶产品。公司总部位于中国（江苏）自贸区连云港片区，参照GMP标准建设与管理；子公司江苏百时美生物科技有限公司位于连云港国家级高新区，主要承担原酶研究和科研试剂生产。秉承愚公移山的精神，愚公生物在国内首次实现了限制性内切酶的规模化生产。现拥有限制酶、PCR、等温扩增、逆转录、荧光定量PCR、修饰克隆、体外转录、速溶颗粒等10个系列上百种产品，进入多家行业龙头企业的供应链。 |
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