发酵过程染菌及防控是每一位发酵人都面临的问题。其中尤其以芽孢杆菌最为头疼。芽孢杆菌因为其独特的结构，使其对各种消毒剂以及高温都有一定的耐受性。因此在日常科研工作中很容易面临被芽孢杆菌污染的问题。那么芽孢杆菌对酸碱和乙醇的耐受性如何？对温度的耐受性如何？怎么样才能测定杀灭和防止芽孢杆菌的污染？
2024年10月修改
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芽孢是微生物适应外界恶劣环境的一种休眠体，一旦外部环境适合其生长繁殖，芽孢将立即活化转变为营养体。营养体不在具有抗逆性。下图（图1）展示了芽孢的显微照片，因为芽孢不能被染色，因此通过简单染色后，会形成中间透明两端有些颜色的芽孢，也存在芽孢仍然在母体内，未被释放的情况（可见图2），表现为在杆菌的一端有一个透明的孢体。
芽孢能够耐受高温、辐射、有毒化学物质、极端pH值，并能在这些环境中潜伏很长时间。芽孢对环境极端条件的耐受性是由芽孢的结构决定的：▷芽孢的最外层exosporium（胞外壁）,含有葡萄糖、脂类、蛋白，是抵抗外部环境的第一道屏障。该屏障能够抵抗大分子物质的破坏，比如水解酶类，抗体类。还能够抵抗由巨噬细胞产生的氧化力。
▷第二道屏障是芽孢的双层膜，spore coat（芽孢衣），芽孢衣能够使得芽孢能够抵抗化学物质的破坏。▷第三道屏障是cortex（皮层），皮层含有肽聚糖，能够阻止小分子亲水物质进入芽孢核心。是芽孢抵抗高温和紫外的保障。吡啶-2,6-二羧酸（dipicolinic acid，DPA）是芽孢杆菌等内生孢子抵抗逆境（如热、辐射）的关键组分，占孢子干重的10-15%。由于芽孢在土壤、水体和动植物表面等环境广泛分布，DPA在环境中也无处不在。据测算仅海洋一公里深的底泥中DPA的含量4.6~35×10^9吨碳元素，占地球生物质碳库的0.8~6%。DPA在孢子萌发后会迅速释放到环境中去。有意思的是，芽孢杆菌不能回收再利用DPA作为营养源。释放的DPA能被其他多种细菌如无色杆菌、产碱杆菌和贪铜菌等降解利用。▷最后，芽孢核心的结构特殊性是芽孢能够抵抗外部极端环境的重要原因。中央核心由核糖体、惰性酶和小酸溶性结合蛋白 (SASP) 组成,这些保护以染色质网络形式存在的DNA。核心的 DNA 中含有高浓度的 SASP、DPA、Ca、Mg和锰，使其能够抵抗高温和辐射。此外皮层能够导致芽孢核心处于干燥状态，从而能够抵抗高温的破坏。
芽孢：细菌芽孢（Spore）是芽孢杆菌属（Bacillus）和梭
菌属（Clostridium）等细菌营养体在环境胁迫（如低
温、干旱和营养缺乏等）条件下形成的一个圆形或椭圆形、壁厚、含水量低、抗逆性强的休眠体，对各种物理和化学杀菌处理有极强的抗性。![]()
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芽孢杆菌对温度具有较强的耐受性，在100℃灭菌10 min芽孢的存活率仍然能达到30%以上。需要说明的是以上数据是在没有任何保护的情况下获得的数据，如果发酵罐或者其他灭菌原料中存在死角，快装物等导致芽孢受到一定的保护，实际温度低于设定温度，或者说湿热蒸汽接触到芽孢的效率低，这样芽孢存活率会更高，另外到芽孢群体大时，芽孢染菌的概率也会更高。75%的乙醇是常用的消毒剂，在75%中浸泡7d，芽孢仍然保留较高的活性。因此75%乙醇并不能用作芽孢灭活，100%的乙醇效果会更差。因此发酵工业在使用甲醇时，并不能保证甲醇原料中没有耐受芽孢。为什么不选100%乙醇：高浓度的乙醇会使得细胞表面蛋白质迅速变性，反而会在细胞外部生成坚固的薄膜，如同一层保护膜，阻止乙醇向细胞内部扩散。细菌或真菌的细胞结构未受到严重破坏，其细胞内部结构中酶的功能也未受到抑制。芽孢杆菌对酸碱都有较强的耐受性，在pH2.0下处理3 h仍然有64.7%的存活率。在用25%的氨水处理7d，仍然保持较高的活性。因此在发酵工业中，如果氨水或者其他调节pH值的稀酸存在被污染的风险，就需考虑氨水等是否是导致染菌的原因。低温、低 pH、低 aw 等条件均可抑制芽孢的萌发生长，相关策略可以用到食品防腐上，但很显然这和微生物发酵背道而驰，因此我们需要想办法杀灭芽孢。芽孢的杀灭方法整体来说可以分为热处理和非热处理两类。一般优先选择高温高压灭菌方法，但是当灭菌对象不能采取高温高压蒸汽灭菌时，可选择过滤除菌，辐照除菌或者化学除菌方法。通过高温可以有效灭活芽孢杆菌，热处理包括湿热灭菌，干热灭菌、火焰灭菌以及巴氏消毒等，前三者是发酵行业中常用的方法，也是最有效的方法和优先选择方法。详细的介绍可查看【发酵基础】常用灭菌、消毒、除菌和防腐方法及其特征。高温高压灭菌的效率受芽孢种类，灭菌对象特征，灭菌温度和压力等因素影响。比如当固体物料或者有大量的固型物存在时，121℃灭菌15min可能不能完全灭活芽孢。此外温度和灭菌时间是两个关键因素，如下表所示，115℃下处理50 min才能达到121℃处理15min的效果。实消：控制罐温在119℃~121℃，罐压维持在0.09 MPa ~0.1MPa（表压）后，保温30 min左右。连续灭菌：连消的灭菌温度多在130℃~140℃。培养基由 泵打进加热器，在15 s~30 s之内被快速加热至灭菌 温度，进入维持器维持5 min~8 min，然后在冷却 器中冷却至40℃~50℃，最后输送至已灭菌的发酵 反应器中。温度和时间是影响灭菌效果的两个重要因素，为了保持培养基中的营养成分，可以选择低温长时间或者高温短时间的策略，如果培养基存在较大染菌风险可以延长时间或者提高温度。连消法：连续灭菌也称连消，指将培养基在发酵反应器 外，通过专门灭菌装置，连续在不同设备中分别进 行加热、维持保温和冷却，然后进入发酵反应器的 灭菌过程。由于芽孢萌发后的营养体非常容易灭活，因此针对芽孢杆菌的灭菌还可以采取另外一种方法：间歇蒸汽灭菌法：对于不耐高温的营养成分灭菌可以采用间歇灭菌法，一般常压蒸汽灭菌，然后降温，待芽孢萌发后再次灭菌。重复3次，可以达到灭菌的效果。对于不耐高温的原料也可采取该方法。其主要原理是芽孢在合适的营养环境下（氨基酸、糖、核苷酸），芽孢能在几分钟内快速萌发。过滤除菌：采用0.22μm的过滤器或者更加高效的过滤器可实现芽孢的去除。比如甲醇、氨水、生物素等可采取该方法进行过滤除菌。需要注意的是要针对原料种类选择不同种类的滤膜（水系和有机系滤膜）。
紫外照射：实验室常用的紫外照射是可以杀灭芽孢的，但灭菌效果较差，杀灭细菌芽孢时应达到100000 uW.s/CM2。紫外灭菌可用于超净工作台，无菌室的照射灭菌。甲醛灭菌：可用于空间灭菌，具体可查阅文末相关推荐阅读。- 几株有益芽孢杆菌对温度及制粒工艺及PH 值的耐受性
