Light | 定量相位显微镜：精度比较

定量相位成像(QPI)是一种针对光束相位成像的光学成像技术，可以弥补普通光学传感器无法进行光学相位探测的缺陷。定量相位成像(QPI)技术在光学显微镜中的广泛应用，催生了与之密切相关的定量相位显微镜(QPM)，极大地扩展了显微镜在细胞生物学中的应用前景。由于细胞折射率与质量密度之间有着密切关系，QPM在细胞生物学中的主要优势之一是它能够测量细胞的干重。

不同的QPM方法会使相似物体呈现完全不同的图像：图1展示了使用CGM、DPM和SLIM成像的神经元细胞。图1(a)和图1(b)中的图像看起来一致，具有凹凸不平的细胞图像，但图1(d)和图1(e)中的细胞看起来是中空的。当OPD图像代表干重密度时，就会发现这些图像可能无法准确反映真实物理量，因为细胞胞体含有大量生物物质，不同的QPM方法将得到不一样的结果。这引发了人们对QPM技术所能达到的准确程度的疑问。

近日，法国艾克斯-马赛大学Guillaume Baffou团队比较了几种最常用的QPM技术，特别是它们的相对准确度，即精确度和真实性。其中包括了8种QPM技术，即DHM, CGM/QLSI, FPM, DPM, PSI, SLIM和TIE。为了全面评估它们的相对准确度，团队给出了8种显微镜所产生图像模型的数值模拟结果。作者团队提出的算法能够计算QPM图像，包括噪声幅度和可能存在的固有伪影。

1. 8种QPM技术工作原理和特性比较

团队首先分析了常见的8种QPM技术，其工作原理图如图2所示。通过对离轴干涉，共线干涉，多明场图像分析等技术原理进行深刻刨析，总结了8种QPM技术的特征，如图3所示。从是否离轴、是否需要多图像，需要图像数量，是否需要相移，透过率，自由度等方面对8种QPM技术进行了比较。

图3. 本研究中提出的QPM技术的技术特点，即QPM测量参量(波前或相位)、QPM类别(离轴，相移，相分集，或共径)、是否需要相干光源(即连续波激光照明)、形成相位/波前图像所需的典型图像数量、实验自由度的数量，以及设置的透过率。

作者选择在数值上比较8种QPM技术，这样就不受技术数量的限制，可以在严格等效的显微镜下，以及在严格相同的物体上比较它们的测试相对准确性。文章中作者用来模拟显微技术的数值工具是基于离散偶极近似(DDA)方法开发的，这是电磁模拟的一种常用方法。DDA算法只需要对物体进行网格划分，而不需要对周围的介质进行网格划分，并且可以很容易地计算到样品界面的电磁场分布情况。基于离散偶极近似(DDA)方法，团队发布了一个自制的DDA工具箱，称为IFDDA (institut-Fresnel或Idiot-Friendly DDA)，它不仅可以模拟光束和物体之间的相互作用，还可以通过模拟显微镜计算这个物体的成像，即成像平面上的电磁场分布。其工作原理如图4，给程序输入照明条件，物体信息，显微镜，相机，通过IFDDA计算相机传感面的光场，最终得到理论图像的波前，相位，强度等信息。

在QPM中，这个最初的电磁场𝐸被光学元件，如光栅，掩模和偏振器转换。为了模拟这个光学元件的转换过程，团队升级了IF-DDA工具箱，使它不再只计算E，还能计算QPM中的各种光学变换。更精确地说，团队对每种QPM技术的所有光学元件(光栅、偏振器和掩模)进行了建模，并计算了相机平面的电场。所有QPMs的数值程序如图4所示。这样，就可以计算出相机记录的每个QPM的原始图像，并使用实验处理算法对其进行处理，得到相位图像φ或波前图像𝑊，就好像它是一个实际的实验图像。然后，我们可以在图像平面上比较真实的参数（𝐼_th，φ_th和𝑊_th）。通过这种方式，所有QPM技术的任何不准确性都可以被证明、量化和比较。

图4. 用IF-DDA计算定量相显微镜图。这张图显示了数值过程，从显微镜样品平面的光场计算，以及使用8种不同的QPM显微镜模型对其进行处理，到类似实验的强度、相位和波前图像的计算。

团队描述了与8种QPM技术(CGM, DHM, DPM, DPC, PSI, FPM, SLIM和TIE)相关的模拟结果，对4个不同的物体成像，分别是金纳米颗粒，细菌，二维（2D）材料和神经元(图5)。选择这些对象是因为它们是较为常见的研究系统，并且覆盖了不同的对象尺寸。这里的目的是研究所有QPM的准确度。准确度通常被定义为正确度和精确度的结合。正确度是指建模图像与真实图像的任何系统偏差，即伪影，而精度是指由图像上的噪声引起的不准确性测量。图6采集了7种显微镜技术对4个目标物体的OPD图像的数值模拟，并与真实的OPD图像(灰线标记为“理论”)进行了比较。在这些模拟图像中，没有添加散粒噪声，以便于比较可能存在的伪影。图7绘制了类似的数据，其中散粒噪声已添加到原始相机图像中。这组图像是为了研究测量的精度，即信噪比。5个被研究的系统是(i)一个空白区域，以更好地量化噪声水平，(ii)一个100纳米金纳米颗粒，(iii)一个细菌，(iv)一个2D材料，(v)一个神经元。图6和7所示的结果突出了不同技术之间不同程度的噪声和与真实值的偏差情况。为了量化这些模拟的QPM的准确性程度，团队从所有模拟图像中测量了生物物理量（细菌和神经元的干质量值），NP的复杂光学偏振性和2D材料的平均OPD。通过对细胞图像进行分割后的像素求和来评估细胞的干质量值，同时测量NP的光学偏振性，如图8。由于纳米粒子是最小的物体，因此测量中存在着最大的不准确性（图8(a)）。即使在无噪声图像中，测量结果也因技术不同而变化，这是因为存在衍射环，使得图像分割更加困难，带来测量误差。无论采用哪种技术，纳米粒子都没有明显的伪影（如图6所示）。同样，无论使用的是哪种QPM，对细菌的测量也不会受到伪影的影响（如图8(b)所示）。相比之下，SLIM技术表现出现轻微的测量偏差。使用DPC、FPM和SLIM技术对于大型物体（如石墨烯（图8(c)）和真核细胞（图8(d)））的测量结果通常是不准确的。图7中观察到的噪声的存在使得生物物理量的测量值更加分散的分布在真实值周围。为了量化这种离散分布趋势，团队进行了12个相同的模拟，对每个测试对象加入随机散粒噪声。这12次测量结果被绘制在图8中，图中给出了所有技术相对准确性的总体概述。

图5. 本研究调查的4个对象。第一列定义其几何形状，第二列显示理论强度图像，第三列显示理论OPD(或波前)图像。

图6. 使用7种不同的波前和相位显微镜技术在同一台显微镜上对4种不同物体的OPD图像进行了28次数值模拟。每列对应一种显微镜技术，每行对应一种物体。对于每张图像，在图像中心下方显示一条水平横截面。背景中的灰色线条表示理论轮廓。

图8. 图6和图7的模拟结果中提取的生物物理量。每张图中的实线连接来自无噪声图像的值，虚线表示真实值。从12张有噪声（理想情况，无斑点）图像中获得的数据点用叉号表示。（a）100纳米金纳米粒子的复光学极化率的测量值（使用每种技术）的图表。（b）细菌的干物质值的图表。（c）二维材料的光学相干断层扫描深度的图表。（d）神经元的干物质值的图表。

作者这篇文章的目的有两方面，(i)提供并分享一个为任何QPM建模量身定制的数值工具箱（IFDDA），(ii)对重要的QPM技术进行比较，作为一种指南，帮助读者在QPM领域找到他们的方法，并为他们的特定应用选择最合适的技术。图9以雷达图的形式直观地总结了结果，以更好地比较所有8种QPM技术的特征。包括9个参数，即精度和正确度，以及测量的简单性、消色差、绝对性质、传输、速度、稳定性和图像清晰度。

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