国自然中标5项——UFMylation的假说机制和研究方法

文摘   2024-11-01 20:04   上海  


UFMylation已成为国自然关注的热点,下面我们将从背景介绍、研究手段、方法、结果分析等角度深入解析这一主题。


一、【背景介绍】UFMylation是什么?

UFMylation是一种较为新型的泛素样修饰,其名称来源于“Ubiquitin-fold modifier 1”(UFM1)。这种修饰过程类似于泛素化,涉及到将UFM1蛋白质通过共价键连接到靶蛋白上。UFMylation在细胞生理过程中起到重要作用,包括细胞应激反应、蛋白质稳定性调控、细胞分化以及各种疾病的发生过程中。

1. UFMylation的组成与激活

UFMylation系统由几个关键组成部分组成:

UFM1:这是UFMylation过程中的主要修饰分子,结构上类似于泛素。

E1激活酶(如UBA5):首先激活UFM1,并将其与ATP一起形成高能硫酯键。

E2结合酶(如UFC1):接收激活的UFM1,并将其转移到特定的底物上。

E3连接酶:促进UFM1与底物蛋白的具体连接。虽然E3连接酶的具体成员较少,但它们在UFMylation的底物特异性中起着关键作用。

2. UFMylation的机制

在UFMylation过程中,UFM1首先由E1激活酶(UBA5)激活,在ATP的消耗下形成UFM1与E1之间的硫酯键。然后,激活的UFM1通过硫酯键转移到E2结合酶(UFC1)。最终,E3连接酶介导UFM1与特定底物蛋白的结合,形成共价键。

3. UFMylation的功能与生物学意义

蛋白质稳定性和降解:UFMylation可以影响蛋白质的稳定性,通过修饰防止其被泛素-蛋白酶体系统降解。

细胞应激反应:在ER应激和其他细胞应激情况下,UFMylation的活动增加,帮助细胞适应不良的生理状态。

细胞分化与发育:UFMylation在某些细胞类型的分化过程中扮演角色,尤其是在神经系统和免疫系统中。

疾病关联:异常的UFMylation活动与多种疾病的发生发展相关,如癌症、神经退行性疾病等。

UFMylation虽然是一个较新的研究领域,但其在细胞生理和病理过程中的重要作用逐渐被揭示,为开发新的治疗策略提供了可能的靶点。


二、【研究手段与方法】UFMylation如何研究?

UFMylation的研究涉及多种技术手段和检测指标,以解析其复杂的生化途径和调控机制。以下是一些关键的研究方法和技术:

1. 基因编辑技术

CRISPR/Cas9系统:用于敲除或敲低UFM1及其相关酶(如UBA5、UFC1等)的基因,以研究其功能缺失对细胞生理和病理状态的影响。

siRNA和shRNA技术:通过这些技术降低UFM1及相关蛋白的表达,用于初步验证基因功能和调控网络。

2. 蛋白质相互作用研究

共免疫沉淀(Co-IP):通过免疫沉淀配合西方印迹(Western blot)检测UFM1与其他蛋白的相互作用

质谱分析:用于鉴定UFM1修饰的底物和交互蛋白,进一步揭示其功能和调控机制。

3. 活性和底物特异性分析

体外酶活性测定:通过重组蛋白和合成底物,测试UFM1的E1、E2和E3酶的活性,以及它们的底物特异性

底物识别实验:使用标记的UFM1蛋白(如带有His标签的UFM1),在体外系统中筛选其潜在的底物

4. 细胞功能分析

细胞增殖和凋亡分析:使用流式细胞仪或细胞存活率检测技术,如MTT、CCK-8试验,评估UFMylation对细胞生长和存活的影响

细胞应激反应实验:通过诱导ER应激或氧化应激,研究UFMylation在应激响应中的角色。

5. 原位和活体成像

免疫荧光和共聚焦显微镜技术:通过这些技术观察UFM1及相关蛋白在细胞中的定位和动态变化

活体成像技术:利用荧光标记的转基因动物模型,研究UFMylation在整个生物体中的作用和功能

6. 疾病模型和病理分析

动物模型:构建特定基因敲除或过表达的小鼠模型,用于研究UFMylation在疾病(如癌症、神经退行性疾病)中的作用

病理学分析:在这些模型中进行组织学和病理学分析,以评估UFMylation对组织结构和功能的影响


三、【结果分析】UFMylation实验结果怎么看?

下面我们来举2个例子带大家一键看懂UFMylation实验结果。

1. Co-IP检测发现二甲双胍有效抑制了SLC7A11 UFM化水平

(PMID:34162423,《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》,中科院一区,IF:11.3)

1)免疫沉淀结果 (IP)

图例:Co-IP实验中使用Flag标签免疫沉淀了SLC7A11,并使用抗Flag抗体检测沉淀效果。

条带解析:

SLC7A11-UFM化共轭:出现在约130 KD的位置,显示了UFM化后的SLC7A11。在添加了二甲双胍(Metformin)的条件下,此条带明显变淡,表示UFM化水平降低

对比数字(1 和 0.13):这些数字可能代表相对定量分析,显示二甲双胍处理组的UFM化水平显著下降到约13%的原水平。

2)输入 (INPUT)

SLC7A11:显示了细胞裂解液中SLC7A11蛋白的整体水平,证明了样品中SLC7A11的存在,并帮助确认免疫沉淀的输入材料一致性。

UFM1:显示了UFM1蛋白的表达水平,确保实验中UFM1蛋白的可用性。

GAPDH:作为内参蛋白,确保各组样品蛋白总量的一致性。

3)实验设计

实验条件:

HA-UFM1, HA-UBA5, HA-UFC1, HA-UFL1:这些标签表明使用了带有HA标签的UFM1系统相关蛋白,便于后续的检测和分析。

Metformin:用于测试二甲双胍对UFM1修饰水平的影响。


2. 质谱分析检测到 PD-L1 的K89 和 K162 可以被 UFM1 共价修饰。

(PMID:36893266,《PNAS》,中科院一区,IF:11.1)

1)质谱图的组成

横轴:表示质荷比(m/z)。

纵轴:表示相对强度(百分比),用来显示不同质荷比离子的相对丰度。

峰标注:图中使用不同颜色的标签(如y和b系列离子标签)标注了主要的裂解离子。y系列离子是从肽的C端开始计数,而b系列离子是从N端开始。

2)解读修饰位点

修饰位点的证据:

在这种分析中,特定的离子峰(如y和b系列)会因为UFM1修饰而显示特征的质量偏移。例如,UFM1修饰会在特定的K(赖氨酸)残基上增加特定的质量(大约为8.5 kDa,UFM1蛋白的质量)。

图中的氨基酸序列(底部)显示了预期的裂解位点,如果K89和K162被修饰,相关的y和b系列离子的质量会相应增加。

3)分析峰的强度和模式

寻找与修饰相关的质量增加:如果K89和K162位点被UFM1修饰,那么在这些位置周围的y和b系列离子的峰应该会显示出相对于未修饰状态更高的质量。


四、【国自然中标统计】UFMylation热度如何?

2023年医学科学部“UFMylation”中标项目5个,热度逐渐攀升。

题目

项目

HIF-1α的UFMylation修饰在肿瘤低氧微环境及治疗中的作用和机制研究

面上项目

UFMylation修饰增强KAT8蛋白稳态促进肿瘤免疫逃逸的机制研究

面上项目

METTL1上调破骨细胞BMP2 UFMylation修饰在强直性脊柱炎病理性成骨中的作用机制研究

面上项目

Ufmylation修饰调控NF-κB介导TNF/IL6/STAT3信号通路在DBP致小鼠睾丸铁死亡的机制研究

地区科学基金项目

UBA5介导的UFM化调控软骨细胞铁死亡在骨关节炎进展中的作用及机制研究

面上项目

中标项目


总而言之,UFMylation作为一种新兴的蛋白质修饰方式,在细胞生理和病理过程中的作用越来越受到关注。随着国自然科学基金对此领域研究的大力支持,未来几年,我们预计将看到UFMylation研究在解析蛋白质稳定性细胞应激响应以及疾病发展等方面取得更多突破。持续的基础研究和技术创新将推动我们深入理解UFMylation的复杂机制,并可能促进新的治疗方法的发展,特别是在癌症和神经退行性疾病等临床难题中,提供新的策略和靶点。这些研究不仅有望揭示细胞内信号传导的新层面,也为未来的临床应用奠定科学基础。



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