导读：2024年5月，西奈山伊坎医学院Nicolas Vabret团队在Cell子刊STAR Protocols分享实验方法：《Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice》。文章详细描述了mRNA疫苗的制备和体内外活性评估实验步骤，包含：mRNA序列设计、体外转录（IVT）模板DNA制备、IVT mRNA制备、mRNA-LNP包封、RNA质量检测和mRNA疫苗的免疫原性、抗原呈递效应评估（体外细胞和体内小鼠试验）。
本期文章，小编将分享mRNA疫苗的T细胞免疫效应评估方法，研究中使用了小鼠模型，对小鼠进行两次疫苗免疫后分离了外周血单核细胞（PBMC）和脾细胞作为样品，检测了抗原特异性T细胞的诱导。
01
小鼠免疫
该Protocol中使用的mRNA癌症疫苗编码SIINFEKL抗原表位（OVA的一个抗原表位）和由Hsf2突变基因编码的黑色素瘤肿瘤新抗原。为分析其在体内的抗原呈递效应，研究人员首先进行了小鼠免疫，随后分析了抗原特异性CD8+ T细胞反应。
小鼠免疫：
Day 1: 腹腔注射（20%氯胺酮+10%甲苯噻嗪）/ 25 g小鼠来麻醉小鼠；小鼠免疫：将10 μg mRNA-LNP经125 μL PBS稀释后经眶后注射免疫小鼠；
注：肌内、皮内、皮下或鼻内等其他给药途径可用于递送mRNA-LNP疫苗，不同的给药途径对免疫反应的动力学和性质的影响不同。
Day 5: 加强针注射：向小鼠体内注射10 μg mRNA-LNP加强针；
Day 8: 样品采集：分离小鼠外周血单核细胞（PBMC）和脾细胞，详见下节内容。
阴性对照：
第一次免疫与加强免疫均使用1x PBS缓冲液。
02
样品采集与分析
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样品采集与分析
免疫小鼠后，需对其进行解剖并采集血液和脾脏组织，从中分离外周血单核细胞（PBMC）和脾细胞，用于后续的分析检测。
实验准备：
1. 在6孔板中加入5 mL冷的RPMI培养基，并准备用于脾脏和血液采集的标记微型采样管；
血液收集：
2. 解剖小鼠：进行心脏穿刺，将针插入心脏左心室，使用注射器采集血液（使用这种方法，每只小鼠最多可采集1 ml血液）；
3. 立即将采集的血液转移到0.5 mL BD K2EDTA采样管中，用移液管缓慢混合，防止形成血栓。将血液放置在缓慢移动的旋转器上，直到收集到所有组织并开始后续实验。
脾脏收集：
4. 心脏穿刺后，用镊子切除脾脏，切断连接脾脏和腹腔的结缔组织；
5. 立即将收集的脾脏转移到准备好的6孔板上（每孔含5 ml RPMI）；把盘子放在冰上，直到采集到所有的组织样品，然后开始后续处理。
外周血单核细胞（PBMC）分离：
6. 将小鼠血液样品转移到15 mL Falcon管中，用1×PBS稀释至6 mL；
7. 加入3 mL Ficoll-paque分离介质（密度1.077 gm/mL）；
8. 轻轻倾斜Falcon管，缓慢地将稀释后的血液平铺在Ficoll-paque的液面上方，这时可以看到两液面清晰分层；
9. 450 g，25℃离心35 min（加速度设置为1，减速度设置为0）；
10. 离心后，PBMC层在血清和ficoll-paque介质之间呈浑浊带状，使用p1000微量移液器将其小心地移至干净的15 mL Falcon管中；
11. 加入1×PBS，使终体积达到15 mL；
12. 用PBS洗涤细胞两次（在500 g，5min，4℃离心）；
13. 吸取上清；
14. 在冷冻瓶中以10 M/mL的细胞密度冷冻细胞；
15. 将冷冻瓶放入Nalgene Mr. Frosty（冷冻容器）中，在-80℃保存24小时后转移到液氮中。
脾细胞分离：
16. 使用扁平的注射器柱塞分离并均质化脾脏组织；
17. 将脾细胞通过70 μm无菌过滤器过滤到50 ml的锥形管中；
18. 加入10 ml预冷的1×PBS洗涤细胞，4℃、500 g下离心5 min；
19. 吸取上清，用5 ml 1x PBS再次洗涤细胞，4℃、500 g下离心5 min；
20. 吸取上清，加入3 ml ACK裂解缓冲液，在冰上孵育5 min；
21. 加入12 mL 1x PBS，500 g、4℃下离心5 min，弃上清；
22. 在冷冻瓶中以10 M/mL的细胞密度冷冻细胞；
23. 将冷冻瓶放入Nalgene Mr. Frosty（冷冻容器）中，在-80℃保存24小时后转移到液氮中；
03
PBMC和脾细胞样品的检测
03
PBMC和脾细胞样品的检测
该Protocol分享了基于MHC四聚体的检测技术，具体检测原理为：在高浓度抗原肽的存在下对MHC分子进行重折叠，然后对MHC的羧基端进行生物素化。MHC/肽复合物与链霉亲和素结合，由于后者有4个生物素结合位点，因此可以将4个MHC分子连接在一个复合物中，形成MHC/肽复合物四聚体，可通过流式细胞仪或免疫磁法进行有效检测。
基于MHC四聚体能够特异性结合T细胞表面受体，且相比MHC单体的亲和力更高，特异性更强。基于MHC 四聚体检测T细胞表面受体的步骤如下：
样品准备：
1. 将37℃预热的RPMI培养基加入15 ml离心管中；
2. 将冷冻保存的PBMC和脾细胞冷冻瓶放置于37℃中解冻，然后转移到用RPMI培养基中；
3. 4℃、500 g下离心5 min；重悬于10 ml PBS中，再次离心洗涤；
4. 使用1 ml PBS重悬，计数；将细胞浓度调整为3×106个细胞/ mL，并在96孔V型板中加200 μL样品；
MHC四聚体染色：
5. 4℃、500 g下离心5 min，弃上清；加入200 μL PBS中重悬，再次离心弃上清；
6. 加入50 μL 2%四聚体染色缓冲液（含50 nM达沙替尼），25℃孵育30 min；
7. 用染色缓冲液1:10稀释四聚体原液；
8. 每孔加入5 μL稀释后的染色液进行染色；
9. 避光条件下冰上孵育30 min；
10. 每孔加入150 μL四聚体染色缓冲液，500 g、4℃离心5 min，弃上清；
11. 重悬于200 μL四聚体染色缓冲液，500 g、4℃再次离心5 min，弃上清；
12. 重悬于100 μL表面染色混合物中；
13. 避光条件下冰上孵育25 min；
14.配制100μL表面染色混合液/每孔，即在四聚体染色缓冲液中添加1/1000 live/dead aqua、1/800 抗CD8 AF647 和1/400的抗CD45 PerCP-Cy5.5、抗CD3 BV421 和抗CD4 BV711；
15.向每个孔中加入100μL四聚体染色缓冲液，500 g、4℃离心5 min，弃上清；
16.使用200μL四聚体染色缓冲液进行重悬，500 g、4℃离心5 min，弃上清；
17.重悬于200μL四聚体染色缓冲液中；
将样品保存在4°C的避光环境中，用于流式细胞术分析。
经MHC染色和流式细胞术分析，研究人员在接种疫苗的小鼠外周血和脾脏样品中检测到抗原特异性CD8+ T细胞。
参考文献
[1] Karekar N, Reid Cahn A, Morla-Folch J, Saffon A, Ward RW, Ananthanarayanan A, Teunissen AJP, Bhardwaj N, Vabret N. Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice. STAR Protoc. 2024 Jun 21;5(2):103087. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103087.
撰写 | 工程菌星球
校稿 | Gddra 编审 | Hide / Blue sea
编辑 设计 | Alice
