科研图文来源于FVPRC Talks，欢迎投稿。
编辑：缪伊雯/ 主编：张大川、蒋羽鸽/ 学术顾问：寇兴然
昆明理工大学果蔬加工与营养健康团队：云南发酵食品中蛋白水解菌的鉴定及其在降低β-乳球蛋白致敏性中的应用
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●近期，昆明理工大学果蔬加工与营养健康团队在微生物发酵方面取得重要进展，发现乳酸菌发酵可以水解β-乳球蛋白降低其致敏性，研究成果“Identification of proteolytic bacteria from Yunnan fermented foods and their use to reduce the allergenicity of β-lactoglobulin”于2024年07月发表在Journal of Dairy Science(IF:3.7)上。2021级硕士杜香为该论文的第一作者，王艳菲讲师为通讯作者。
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成果介绍
研究背景
牛奶及其衍生乳制品对儿童的生长发育重要。然而，牛奶蛋白过敏(cow’s milk protein allergy，CMPA)是世界上最常见的食物过敏之一。轻者出现呕吐和腹泻，重者出现过敏性休克并窒息。牛奶中的过敏原多种多样，在众多致敏蛋白中，β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）不存在于人乳中，被认为是最重要的牛奶致敏原之一。除了常见的婴幼儿配方乳粉外，大量研究也表明乳酸菌在还原β-LG方面具有巨大的潜力和应用价值。然而，由于菌株的特异性，目前能够有效水解β-LG的乳酸菌仍然很少，适合工业应用。因此，本研究旨在筛选云南发酵食品中能够有效水解牛奶中β-LG的乳酸菌。通过筛选鉴定出优势菌株，并评估了它们在降低牛奶中β-LG致敏性方面的潜在应用，进一步通过全基因组分析进一步解释微生物发酵水解蛋白质的机制。
内容与结果
本研究共从传统发酵食品中分离到105株乳酸菌，并根据16SrRNA进行鉴定，根据SDS-PAGE结果，P. pentosaceus C1001(从发酵大豆中分离)；P. acidilactici E1601-1(从干酸菜中分离)和L. paracasei E1601-2(从干酸菜中分离)表现出更大的水解活性。且β-LG水解在初始0-3h内最为明显，之后反应速率降低。这可能是由于静置30分钟后氨基酸饥饿，导致发酵早期对氨基酸的需求更大。从3h到24h，3株菌株的蛋白质水解程度明显降低，电泳条带变化不明显，但水解前后的条带比较仍有明显变化。RP-HPLC分析结果与SDS-PAGE分析结果一致。与天然β-LG相比的峰强度降低，出现了较小的较亲水性峰，表明产生了中等大小的肽，疏水特性降低。并且其上清中释放出大量的氨基酸，其中L. paracasei E1601-2水解后上清中的游离氨基酸含量最高，且三株菌所释放的氨基酸种类及含量不相同说明不同乳酸菌水解蛋白的偏好位点不同所释放的肽以及氨基酸有所差异。虽然微生物发酵可以部分降低β-LG的含量，但仍有一部分水解的β-LG存在，说明发酵乳仍有致敏的可能。此外，对水解肽的分析对于确定它们是否具有显著的致敏性至关重要。
本研究进一步对其水解产物进行分析，ELISA分析其水解产物的致敏性，结果表明经乳酸菌水解后，抗原性降低率增加。当β-LG被P. pentosaceus C1001和L. paracasei E1601-2的抗原性降低率约为50%；P. acidilactici E1601-1约为40%。结合LC-MS/MS分析其水解后的多肽，L. paracasei E1601-2获得的水解产物共检测到分子量在815.335–1717.853 Da范围内的肽段23条。截断最多的致敏性表位是V41–K60，共11条，截断致敏性表位L149–162共6条。在致敏性表位Y102-R124中，只有一个肽段在氨基末端含有精氨酸残基。P. pentosaceus C1001和P. acidilactici E1601-1水解β-LG都释放出22条肽段，相比L. paracasei E1610-2较少的位于致敏性肽段。这表明，乳酸菌释放的酶有效地切割了蛋白表面的致敏表位，从而降低了抗原的免疫反应性。
乳杆菌和片球菌蛋白水解系统存在差异性，使得其水解蛋白的位点以及水解蛋白的程度存在差异性，全基因组分析三个乳酸菌P. acidilactici E1601-1，P. pentosaceus C1001，L. paracasei E1601-2所编码的与蛋白水解相关的基因，三者都含有大量的肽转运基因（二/三肽dpp和dtpT系统以及寡肽opp系统）和肽酶基因（pepO、pepF、pepG和pepE），P. pentosaceus C1001和P. acidilactici E1601-1不含胞外蛋白酶编码基因。L. paracasei E1601-2含有胞外蛋白酶编码基因（prtP）并具有完整蛋白水解系统，这可能更有利于它们更好地水解和利用蛋白质，释放出较多不完整的致敏性片段多肽，从而使得蛋白与抗原的结合能力降低，降低其致敏性。
结论
在本研究中，从云南传统发酵食品中分离到3株乳酸菌(P. pentosaceus C1001,P. acidilactici E1601-1和L. paracasei E1601-2，能有效水解β-LG的致敏片段V41-K60和L149-I162。虽然靶向过敏表位Y102-R124的肽片段没有被释放，但它们对β-LG的抗原性降低率仍然很高。通过基因型分析，3株菌株各方面存在差异，L. paracasei E1601-2具有更完整的蛋白水解体系，能够水解更多的致敏蛋白片段。
本研究得到云南省科技计划项目(202102AE090050)、云南省基础研究计划项目(202301AU070075)的资助。
参考文献
https://doi.org/10.3168/jds.2024-25055
专家/团队介绍
王艳菲，女，1992年2月出生，工学博士，昆明理工大学食品科学与工程学院讲师，硕士生导师，兼职食品科学与工程学院研教办主任。主要从事功能性益生菌的筛选与应用。本硕博均就读于东北农业大学，获食品科学工学博士学位。发表论文10篇，申请专利9项。
杜香，女，汉族，2021级昆明理工大学硕士，主要研究方向是乳酸菌发酵水解β-乳球蛋白降低其致敏性研究，以第一作者发表论文1篇，申请发明专利1项。
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