Cell Host＆Microbe | 乔杰/庞艳莉-肠道真菌塔宾曲霉通过次级代谢物促进多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome, PCOS）影响6%–10%的育龄女性，已知与肠道细菌失调有关。然而，肠道真菌群落在PCOS病理中的作用尚不清楚。通过依赖培养和内部转录间隔区2（ITS2）测序方法，我们在来自中国三个不同地理区域的226名有无PCOS的个体中发现肠道可定植真菌塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）的富集。将塔宾曲霉定植于小鼠，导致PCOS样表型，这是由于在肠道3型天然淋巴细胞（innate lymphoid cells, ILC3s）中抑制了芳烃受体（Aryl hydrocarbon receptor, AhR）信号传导和减少白细胞介素（IL）-22分泌。通过开发基于菌株多样性的活性代谢物筛选工作流程，我们鉴定了次级代谢物AT-C1，它是内源性AhR拮抗剂，也是PCOS的关键介质。我们的发现表明，肠道真菌及其次级代谢物在PCOS发病机制中起着关键作用，为改善该疾病的管理提供了治疗策略。

● 肠道可定植真菌塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）在多囊卵巢综合征患者中富集

● 塔宾曲霉通过肠道 AhR-IL-22 轴在 ILC3 中诱导小鼠 PCOS 样表型

● 管状真菌的次级代谢产物 AT-C1 是一种内源性 AhR 拮抗剂

● AT-C1 与多囊卵巢综合征患者的症状呈正相关

为了研究肠道真菌群落在PCOS中的潜在作用，我们在华北地区招募了67名符合鹿特丹标准的PCOS患者和63名健康女性作为对照（队列1，北京，图1A）。队列的临床特征如表S1所示，包括年龄、体重指数、腰臀比和血液生化指标。两组之间的年龄、体重指数、腰臀比、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone, FSH）、雌二醇、空腹血糖、胰岛素水平、胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment for IR, HOMA-IR）、胆固醇、甘油三酯以及高密度和低密度脂蛋白水平没有显著差异。然而，PCOS患者的血浆促黄体激素（luteinizing hormone, LH）、睾酮、雄烯二酮和硫酸脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAs）水平显著更高。通过ITS2基因序列（图S1A和S1B），我们发现两组之间的真菌β多样性没有显著差异（图S1C）。然而，在属水平上，我们发现PCOS患者中曲霉属的丰度显著增加（图S1D）。线性判别分析效应大小（Linear discriminant analysis effect size, LEfSe）识别出塔宾曲霉和热带假丝酵母（Candida tropicalis）作为与健康对照相比在PCOS患者中丰度增加的可区分物种（图1B和1C），我们进一步通过火山图评估和相对丰度分析进行了确认（图1D–1F）。

图 1 | 塔宾曲霉在PCOS患者中显著富集

尽管基于测序的分析对于提供粪便中真菌DNA的快照很有用，但无法可靠地确定相关生物体是被动的旁观者还是特定生态位的活体居民。因此，我们接下来使用培养方法来确定PCOS患者与健康对照相比粪便中活体真菌的变化。随机选择20名健康对照和20名PCOS患者的粪便样本，并在Dixon琼脂上培养，这是一种通用的肠道真菌培养基。共回收了685个分离株，通过每个分离株的全长ITS测序后分为36个物种（图1G；表S2）。结合扩增子测序和真菌培养方法，我们确定塔宾曲霉是PCOS组中最显著富集的真菌物种，而PCOS患者与健康对照之间热带假丝酵母的可培养菌株数量相似（图1G）。

为了进一步确认PCOS患者中塔宾曲霉的富集，我们进行了碳水化合物活性酶（CAZyme）分析，以确定塔宾曲霉生长的最佳培养基条件，并发现塔宾曲霉中富含果胶酶。这一结果表明，使用果胶作为唯一碳源的果胶培养基是塔宾曲霉富集培养基。一致地，使用最佳培养基，我们观察到PCOS组中塔宾曲霉的更明显富集（图1H）。为了进一步验证PCOS中塔宾曲霉的增加，我们从对照组和PCOS患者的粪便样本中提取DNA，并对塔宾曲霉系统发育关系分析的两个标记基因β-微管蛋白和Cyp51a进行了实时PCR。与上述结果一致，与对照组相比，PCOS样本中塔宾曲霉显著富集（图1I和1J）。地理位置是影响真菌分布和组成的关键因素。因此，我们招募了另外两个队列，包括位于中国西南部（队列2，贵州，n=26名健康志愿者，n=29名PCOS患者）和中国东北部（队列3，黑龙江，n=19名健康志愿者，n=22名PCOS患者），以评估塔宾曲霉是否也在其他地理区域的PCOS女性中富集（图1A和S1E–S1T；表S3和S4）。三个区域PCOS患者的真菌组成变化并不完全相同。哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania humilis）、胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）、毕赤酵母（Pichia fermentans）、总状毛霉（Mucor recemosus）和副鲁氏威克哈米氏菌（Wickerhamiella pararugosa）仅在一个PCOS患者队列中发现增加，而黑曲霉菌（Aspergillus niger）和球毛壳菌（Chaetomium globosum）在两个PCOS患者队列中增加（图1G，S1M和S1Q）。值得注意的是，通过培养和测序方法在三个队列中都能检测到塔宾曲霉的存在，并且与各自对照组相比，在PCOS患者中显著更高（图S1M–S1T），表明塔宾曲霉与PCOS的发生密切相关，并且不受地区限制。

作为曲霉属黑曲霉复合体的隐秘物种，塔宾曲霉是一种普遍存在的环境霉菌，并且已报道在人体的几个部位发现，如实体瘤和皮肤感染。如上所述，我们通过ITS2基因序列和培养检测在所有三个队列中都检测到了塔宾曲霉的存在，表明塔宾曲霉是一种广泛分布的肠道真菌。然而，塔宾曲霉是否是肠道可定植真菌居民尚不清楚，需要更多证据。

首先，我们对所有粪便衍生的塔宾曲霉分离株和环境塔宾曲霉进行了全基因组测序。通过比较环境和肠道塔宾曲霉菌株在基因组水平上的系统发育关系，我们发现肠道塔宾曲霉菌株形成了与环境菌株不同的独立分支（图2A和2B），表明肠道分离株和环境塔宾曲霉菌株之间存在进化差异。为了评估塔宾曲霉是否能够定植于胃肠道，我们选择了一株从PCOS患者粪便中分离的塔宾曲霉菌株（塔宾曲霉 HFAT-15，图2A），通过灌胃给予无菌（GF）小鼠；通过测序和培养检测每日监测粪便中的塔宾曲霉水平（图2C）。我们发现，在单次灌胃塔宾曲霉后30天内可以检测到较高的真菌负荷，而环境分离株（塔宾曲霉 CGMCC3.6401，来自中国普通微生物培养物保藏中心）的定植效果较差（图2D和S2A）。值得注意的是，塔宾曲霉的定植在特定病原体自由（SPF）小鼠中在30天检测期间也是稳定的（图2E，2F和S2B）。

图 2 | 塔宾曲霉是肠道可定植真菌成员

我们进一步探索塔宾曲霉是否是肠道适应真菌，发现模拟体内环境温度（37°C）下培养的肠道塔宾曲霉 HFAT-15的生长速率和菌落直径比在28°C下培养的塔宾曲霉 HFAT-15更快更大（图2G，S2C和S2D），并且显示出增加的菌丝重量（图2H）。肠道塔宾曲霉在37°C下形成的孢子也比在28°C下形成的孢子多（图2H），这有助于更快的繁殖速率和更好的温度适应。此外，我们探索了塔宾曲霉 HFAT-15在不同氧条件下的生长状态，发现它在完全厌氧条件下不能生长（图2I，2J，S2E和S2F）。然而，塔宾曲霉 HFAT-15在微氧条件下的生长状态与其在有氧条件下的生长速率相似（图2I，2J，S2E和S2F），这与塔宾曲霉 HFAT-15定植部位的检测一致，我们发现塔宾曲霉主要分布在回肠内容物中（图S2G–S2J），其特点是微氧条件。

肠道可定植真菌需要适应肠道生态位中特定的环境条件和营养物质，这为识别真正的可定植真菌提供了另一个有用线索。因此，我们进一步确定了从人类粪便培养中获得的肠道塔宾曲霉菌株的底物利用特征。选择了五个来自不同收集地点（土壤或植物叶片）的环境塔宾曲霉分离株，以及五个代表性的人类粪便衍生的塔宾曲霉菌株，在Biolog平台上进行真菌底物利用分析。没有塔宾曲霉分离株能有效利用葡萄糖胺、富马酸、羟基丁酸或其衍生物，而所有分离株都能强烈代谢葡萄糖和果糖（图2K）。值得注意的是，人类粪便衍生的塔宾曲霉分离株能有效利用肠道富集的营养物质，如L-苏氨酸和N-乙酰-β-D-葡糖胺，而所有环境塔宾曲霉都能有效代谢麦芽糖和麦芽糖衍生物（图2K），其含量在植物叶片中更高。上述证据表明，塔宾曲霉是一种肠道可定植真菌，可能在宿主中发挥长期慢性作用。

为了进一步探索塔宾曲霉在人类肠道中的广泛分布，我们分析了全球肠道真菌研究的ITS数据（5,371个样本，来自10个国家的15个队列），发现塔宾曲霉谱系在全球范围内普遍存在（表S5）。我们进一步注释并重新分析了高质量的宏基因组数据（636个样本，来自6个国家的 7 个队列），重点研究了塔宾曲霉的特征基因，结果发现塔宾曲霉的流行率接近 100%（表 S6）、进一步表明它在人类肠道中的普遍性。

在确定塔宾曲霉是肠道居民且在PCOS患者中丰度增加后，我们接下来旨在探索塔宾曲霉是否在PCOS表型的发病机制中发挥作用。通过口服灌胃将塔宾曲霉 HFAT-15给予SPF小鼠，而对照组给予灭活的塔宾曲霉和PBS（图3A）。与对照组相比，灌胃塔宾曲霉导致LH脉冲受损（图S2K–S2O）、发情周期紊乱（图3B和3C）、睾酮和LH水平升高（图3D和3E），以及卵巢中黄体数量减少（图3F，3G和S2P）。此外，活塔宾曲霉处理组表现出更严重的胰岛素抵抗（IR），这通过葡萄糖耐受性测试（glucose tolerance tests, GTTs）、胰岛素耐受性测试（insulin tolerance tests, ITTs）、空腹胰岛素和HOMA-IR揭示出来，与对照组相比（图S2Q–S2U），以及减少的脂肪生成性产热（图S2V和S2W）。然而，在灭活塔宾曲霉灌胃组中，卵巢功能和胰岛素敏感性的损害与对照组相比并未观察到（图3A–3G和S2K–S2W）。

为了进一步测试塔宾曲霉反应的特异性，我们通过灌胃将热带假丝酵母给予小鼠（图S2X和S2Y），该菌株在测序中富集但在培养中未富集，发现对IR（图S2Z–S2AB）或发情周期（图S2AC和S2AD）没有显著影响。这些结果表明，塔宾曲霉是参与PCOS发病机制的关键肠道真菌物种。

随后，我们旨在确定塔宾曲霉诱导PCOS样表型的潜在机制。宿主免疫受到真菌群落诱导的宿主健康破坏的深刻影响。为了探索塔宾曲霉对宿主免疫的影响，我们通过灌胃给予小鼠塔宾曲霉 HFAT-15，并使用Luminex xMAP多分析物分析法在蛋白水平上检测小肠组织中主要免疫细胞分泌的特征细胞因子。在25种特征细胞因子中，IL-22是在塔宾曲霉灌胃后下调最显著的细胞因子（图3H）。相应地，小肠组织中IL-22的mRNA表达水平在塔宾曲霉灌胃组中也显示出最大的下降（图3I）。一致地，塔宾曲霉定植抑制了肠道、血浆和卵巢中IL-22的水平，通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）验证（图3J–3L）。上述证据表明，塔宾曲霉显著抑制IL-22水平。我们和其他人已经表明，IL-22在调节PCOS中发挥关键作用，通过促进脂肪组织褐变、增加胰岛素敏感性以及直接抑制卵巢颗粒细胞的炎症，从而改善卵巢功能，这支持了IL-22抑制在塔宾曲霉诱导的PCOS中的潜在作用。

图 3 | 塔宾曲霉抑制IL-22并诱导PCOS

为了研究IL-22在塔宾曲霉诱导的PCOS样表型中的作用，塔宾曲霉灌胃小鼠通过腹腔注射给予IL-22（图3M）。这种处理显著防止了IR的出现（图S3A–S3E）、脂肪组织褐变的减少（图S3F和S3G）、发情周期紊乱（图3N和3O）、异常激素水平（图3P和3Q）以及卵巢形态变化（图3R和3S）。在Il22r-/-小鼠中，塔宾曲霉给药不能加剧Il22r阻断对PCOS样表型的影响（图S3H–S3R），包括激素变化和IR，表明IL-22途径在塔宾曲霉诱导的PCOS样表型中起着关键作用。

为了确定塔宾曲霉抑制的肠道IL-22产生细胞类型，我们通过流式细胞术检测了主要的IL-22产生细胞，包括ILC3s、CD4+T细胞和γδT细胞（图S4A–S4C）。我们发现，与对照组相比，塔宾曲霉处理组中IL-22+ILC3s的百分比和数量显著降低（图4A–4C），而CD4+T细胞和γδT细胞的IL-22产生在两组之间没有显著变化（图4B，4C，S4D和S4E）。我们分析了塔宾曲霉对Rag1-/-小鼠的影响，这些小鼠缺乏T细胞和B细胞（图S4F），发现塔宾曲霉处理仍然抑制肠道IL-22水平（图S4G）。此外，塔宾曲霉在Rag1-/-小鼠中的处理与野生型小鼠中塔宾曲霉诱导的PCOS样表型相似（图S4H–S4P）。

图4 | 塔宾曲霉抑制IL-22并诱导PCOS

为了验证塔宾曲霉是否通过AhR途径抑制ILC3s来源的IL-22，我们用AhR激动剂靛蓝处理塔宾曲霉诱导的PCOS样小鼠，并通过流式细胞术分析RORgT+ILC3s中IL-22+细胞的百分比和数量。如预期，靛蓝处理防止了塔宾曲霉对IL-22产生的抑制作用（图4J–4L）。在为期4周的治疗实验中（图4M），靛蓝处理改善了塔宾曲霉诱导的PCOS样小鼠的紊乱发情周期（图4N和4O）、紊乱的激素（图S5A和S5B）和IR（图S5C–S5G）。此外，在AhrDRorc小鼠中定植塔宾曲霉并未导致PCOS样表型的加剧，靛蓝治疗在改善塔宾曲霉定植AhrDRorc小鼠的PCOS样表型中也无效（图4P，4Q和S5H–S5N），这表明基于ILC3s的AhR信号在塔宾曲霉诱导的PCOS中起作用。

为了剖析塔宾曲霉诱导ILC3来源IL-22减少的确切机制，我们鉴定了从小鼠肠道中分离的ILC3s的全基因组表达谱（图S4Q）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示‘药物代谢—细胞色素P450’和‘细胞色素P450的外源物代谢’通路富集（图S4R），这表明AhR相关途径发生了变化，AhR是外源物代谢和ILC3s中IL-22产生的主要转录因子。火山图还显示AhR途径下游基因Kit、Il22、Cyp1a1和Cyp1b1显著下调（图4D），并且这一发现通过实时PCR进一步验证（图S4S）。

然后，我们通过将携带floxed Ahr等位基因（Ahrfl/fl）的小鼠与表达Rorc启动子驱动的Cre重组酶的小鼠杂交，生成了RORgT+细胞特异性AhR缺失模型（AhrDRorc小鼠）（图S4T）。与Ahrfl/fl小鼠相比，AhrDRorc小鼠显示出肠道IL22水平降低（图S4U），以及发情周期紊乱（图4F和4G）、异常激素（图4H和4I）和增加的IR（图S4V–S4Z），表明ILC3s中的AhR参与PCOS的发病机制。

许多观察表明，细菌和真菌在肠道中相互作用，它们通过多种不同的机制相互影响。为了探索观察到的ILC3-AhR-IL-22途径抑制是否是由于细菌-真菌相互作用，我们对塔宾曲霉灌胃的SPF小鼠进行了额外的细菌丰度分析，并估计了生态网络。在塔宾曲霉灌胃后对肠道内容物进行了宏基因组分析。值得注意的是，塔宾曲霉处理并未改变肠道细菌整体分布的α和β多样性（图S5O–S5Q），并且被认为诱导PCOS的肠道细菌普通拟杆菌（B.vulgatus）的丰度也未改变（图S5R）。此外，我们在GF小鼠中定植塔宾曲霉，以确定在没有其他微生物的情况下塔宾曲霉本身对ILC3s AhR信号和PCOS样表型的影响（图4R，S5S和S5T）。在GF小鼠模型中，RORgT+ILC3s中IL-22+细胞的百分比和数量也显著降低（图S5U–S5W），以及肠道IL-22水平显著降低（图S5X）。此外，塔宾曲霉在GF小鼠中的定植有效地诱导了PCOS样表型（图4S–4X和S5Y–S5AC）。然而，灭活塔宾曲霉灌胃对ILC3s的IL-22产生、卵巢功能、激素水平和IR没有显著影响（图4S–4X和S5U–S5AC）。这些数据表明塔宾曲霉在ILC3s AhR-IL-22途径和PCOS样表型的发展中起着独立作用。

我们随后研究了塔宾曲霉中影响ILC3 AhR信号的具体成分。与塔宾曲霉灌胃在体内的效果一致，塔宾曲霉提取物处理显著降低了从小肠中分离的ILC3s中IL-22的mRNA和分泌蛋白水平（图5A和5B）。人类AhR荧光素酶报告基因检测显示，塔宾曲霉提取物显著抑制了AhR的转录活性，而其他分离真菌的提取物对AhR的转录活性影响很小（图5C和S6A）。为了鉴定塔宾曲霉提取物中负责AhR抑制效果的成分，我们使用1-和10-kDa分子量截止膜将提取物分离成三个分子量分数。我们发现，>10-kDa和1–10-kDa分数未能抑制AhR的转录活性，而<1-kDa分数的处理导致转录活性显著降低（图5D），表明某些小分子代谢物参与了AhR的抑制。

图 5 | 塔宾曲霉通过产生内源性AhR拮抗剂诱导PCOS

为了鉴定负责AhR抑制的代谢物，我们开发了一种称为基于菌株多样性的活性代谢物筛选（strain-diversity-based-activity metabolites screening, SDAMS）的实验工作流程，可以定位特定活性代谢物的关键特征（图5E）。该工作流程基于不同菌株的遗传和功能多样性。同一物种内的菌株可能由于基因调控水平不同、环境适应和沉默基因簇的激活而表现出不同的活性代谢物，从而对特定目标产生不同的活性。使用临床相关浓度（100 mg/mL）的塔宾曲霉不同菌株检测AhR活性，大多数菌株显示出强烈的抑制效果（图S6B）。为了利用不同菌株的活性差异定位活性物质，我们进一步使用低浓度的菌株（10 mg/mL）进行比较代谢组分析，显示出不同的效果。基于这一概念，我们筛选了23株塔宾曲霉，这些菌株是从粪便样本中以低剂量用于AhR抑制活性检测和非靶向代谢组分析的。通过相关性分析和丰度检测，在6,610个分析物中，一个m/z 289.0717（[M-H]−）的分析物与AhR抑制活性的相关性最高且丰度最大（图5F和5G）。因此，我们推测这种塔宾曲霉衍生的分析物是一种潜在的AhR拮抗剂。 

为了鉴定分析物（m/z 289.0717（[M-H]−））的化学结构，我们进行了塔宾曲霉的发酵和化学研究，并结合特征分子量检测，包括在固定相和色谱条件下展示相同的高分辨率MS/MS光谱和保留时间。我们最终分离出了特定的分析物，并将其命名为AT-C1（图5H）。通过核磁共振（NMR）和串联质谱（MS）表征，AT-C1具有与fonsecin相同的平面结构（图S6C和S6D），fonsecin是之前从曲霉属中发现的吡喃萘酚化合物。此外，我们检测了AT-C1的比旋光度为−65.2，结合圆二色谱仪检测到的340 nm处的负Cotton效应，并确定了AT-C1的绝对构型为3R。AhR荧光素酶报告基因检测显示，AT-C1具有强烈的抑制效果，IC50为4.68 μM（图5I）。微量热泳动（MST）允许基于温度诱导的目标荧光和非荧光配体之间的相互作用变化进行测量。我们进行了MST以验证AT-C1与AhR之间的相互作用，并确认了AT-C1与AhR的结合，Kd=8.70 μM（图5J）。

AT-C1在所有检测的SPF小鼠的粪便和肠道组织中均可检测到，并且在塔宾曲霉灌胃后显著增加，肠道组织中的浓度为10.1–19.7 nmol/g（图6B）。然而，AT-C1在血浆或卵巢中无法检测到（图6A和6B）。对于GF小鼠的粪便，野生型GF小鼠中无法检测到AT-C1，但在塔宾曲霉定植后我们看到了显著增加（图6C）。

图 6 | 塔宾曲霉产生的AT-C1是内源性AhR拮抗剂并诱导PCOS

我们接下来用AT-C1处理ILC3s，发现这种处理降低了IL-22的mRNA水平和分泌量（图6D和6E）。此外，通过口服灌胃给予小鼠AT-C1降低了IL-22+ILC3s的百分比和数量（图6F–6H），表明AT-C1抑制了ILC3-IL-22途径，这与上述塔宾曲霉处理观察到的结果一致。 

  为了确定AT-C1在PCOS发病机制中的作用，通过口服灌胃给予小鼠AT-C1。与对照组相比，灌胃AT-C1的小鼠表型模拟了塔宾曲霉诱导的PCOS；此外，IL-22治疗防止了AT-C1给药诱导的这些效应（图6I–6M和S7A–S7G）。此外，靛蓝治疗也防止了AT-C1给药诱导的这些效应（图6N–6T和S7H–S7L）。与塔宾曲霉的效果一致，AhrDRorc小鼠灌胃AT-C1并未表现出加剧的PCOS样表型，靛蓝治疗在改善处理小鼠的PCOS样表型中也无效（图S7M–S7V）。这些数据表明，AT-C1像塔宾曲霉一样，可以通过ILC3-AhR依赖途径在小鼠中诱导PCOS样表型。

为了进一步研究AT-C1与多囊卵巢综合征之间的关系，我们分析了队列1中多囊卵巢综合征患者粪便中AT-C1的丰度，并与临床多囊卵巢综合征指标（包括血液中IL-22水平和雄激素水平）进行了相关性分析。与健康人相比，我们发现多囊卵巢综合征患者粪便中的 AT-C1 水平显著增高，血浆 IL-22 浓度下降（图 7A 和 7B）。AT-C1 水平与 IL-22 水平呈强负相关（图 7C）。AT-C1 水平与多囊卵巢综合征患者临床指标的进一步相关性分析表明，AT-C1 与 LH 和水平呈正相关（图 7D），而 LH 和水平是多囊卵巢综合征的重要指标。此外，我们还对队列 2 和队列 3 中的 AT-C1 和多囊卵巢综合征临床指标进行了全面的相关性分析，得出了与队列 1 相似的结论（图 7E-7L）。

图 7 | AT-C1与PCOS指标之间的相关性

北京大学第三医院女性生育力促进国家重点实验室生殖医学中心妇产科吴佳玉为本文的第一作者，中国工程院院士乔杰和北京大学第三医院妇产科生殖医学中心研究员庞艳莉为本文的通讯作者。

翻译：杨海飞，青岛农业大学，基因组所联培硕士在读

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导

排版：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读