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双特异性抗体

双特异性抗体（BsAbs）是单克隆抗体药物衍生出来的形式之一，通常被设计为具有与传统单克隆抗体（mAb）相似的表位特异性和可制造性，但经过工程化处理，能够同时结合两个不同的靶标。与传统单克隆抗体（mAbs）相比，BsAbs不仅可以同时靶向多种疾病相关抗原，还能激活免疫系统，从而增强抗肿瘤或抗感染治疗的效果。

双抗与单抗相比的优劣

双特异性抗体（BsAbs）能够同时特异性结合两个不同的抗原表位，这一特性需要对抗原结合部位（可变区）进行结构设计。与化学偶联法和双杂交瘤融合法相比，基因工程法因其多样化设计、精确控制和适合大规模生产的优势而备受关注。通过基因工程设计，BsAbs的结构已经发展出超过100种，主要根据是否含有Fc片段进行分类，分为不含Fc片段（no-IgG-like BsAb）和含Fc片段（IgG-like BsAb）。

IgG-like BsAb可以根据其对称性进一步分为对称性和不对称性两种类型。IgG-like BsAb具有Fc片段，因此可以发挥Fc介导的效应功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）。由于其Fc片段能够与FcRn受体结合，IgG-like BsAb具有较长的血清半衰期，在给药频次方面可能更具优势。

no-IgG-like BsAb通过结构设计，将多个抗原结合单元整合在不含Fc片段的分子上，从而避免了抗体重链和轻链之间的误配对。然而，这种设计也意味着它们缺乏由Fc片段介导的效应功能。no-IgG-like BsAb具有更快的体内清除速度和较短的半衰期，这可能使其在某些不良反应方面具有潜在的优势。

双特异性抗体常见结构举例

能同时结合两种不同靶标的BsAbs在作用机制上与单克隆抗体有区别吗？其主要作用机制包括以下四个方面：

• 桥连细胞机制：这一类BsAbs能够同时结合两种不同的细胞表面受体，一个位于效应细胞（如T细胞）表面，另一个位于目标或肿瘤细胞表面。通过这种结合，BsAbs能够激活下游信号通路并杀死目标细胞。最典型的例子是T细胞衔接器（T-cell Engager, TCE），这种BsAb可以桥接目标细胞表面的肿瘤特异性抗原和细胞毒性T细胞受体上的CD3，形成免疫突触。此过程诱导T细胞激活，导致穿孔素和颗粒酶的释放，从而裂解目标细胞。

  
  

• 桥连受体机制：BsAbs可以靶向多个受体，在特定的细胞环境中发挥阻断或激活受体的作用。例如，肿瘤等疾病的发展通常涉及多条信号通路，BsAb能够同时特异性地阻断多条信号通路、蛋白质或新生血管的生成，从而抑制疾病进程。此外，BsAb还可以通过将受体桥联在一起，激活下游信号通路，产生新的生物学信号和功能，以实现其预期的治疗效果。

• 桥连因子：BsAbs可以促进蛋白复合物和膜受体蛋白复合物的形成，从而增强抗体药物偶联物或激动性抗体的活性。一个著名的例子是Emicizumab（Hemlibra®），它能够模拟凝血因子Ⅷa的功能，使凝血因子Ⅸa催化凝血因子X转化为凝血因子Xa，从而发挥止血作用，用于治疗血友病A。

  
  

• 递送分子：其中一个结合位点能够在特定的环境中结合，并将分子运送到难以到达的目标位置，以发挥治疗作用。例如，aCD63/aHER2-ADC结合到CD64受体，将药物递送至溶酶体，同时aHER2部分提供肿瘤特异性，使药物释放更加有效。目前应用这一机制的药物相对较少。

  
  

双特异性抗体作用机制示意图

随着技术的进步和对其作用机制理解的深入，BsAbs在肿瘤学、免疫学及感染病学等领域的应用不断扩展。随着更多BsAbs进入临床试验和市场，对这一生物制剂的期待与日俱增。然而，其复杂的结构和多重作用机制，给结构和功能表征带来了进一步的挑战。

与传统单克隆抗体相比，双特异性抗体的结构和功能表征需要采用更高分辨率的分析方法来确认其异质性、正确的配对和功能活性。在BsAbs的亚基水平分析中，IgdE蛋白酶作为一种必不可少的工具酶，对设备要求较低，能够满足大部分的结构和功能表征需求。

IgdE蛋白酶

IgdE蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族C113的创始成员，属于高度特异性的蛋白酶（MEROPS数据库），其可在铰链区上方的特定位点对IgG进行酶解，生成均一的Fab和Fc片段。在抗体药物开发过程中，研究人员利用IgdE进行对候选抗体的裂解和表征，以确保其具备预期的功能特性和高质量。此外，IgdE还被广泛应用于开发新的抗体片段和工程化抗体，例如单链抗体（scFv）和双特异性抗体（BsAbs）。通过IgdE的裂解，获得的抗体片段可以进一步进行修饰和工程化，从而增强其功能性和适用范围。

IgdE蛋白酶最初在Streptococcus suis（S. suis）中被发现，展示了对猪IgG的高度特异性。通过生物信息学分析进一步确认，在多种链球菌中存在潜在的IgdE蛋白酶成员，包括S. agalactiae、S. porcinus、S. pseudoporcinus和S. equi。

具体而言，来自S. agalactiae和S. pseudoporcinus的IgdE蛋白酶能够裂解人类IgG1，而S. equi的IgdE蛋白酶则具有对马IgG7的特异性。这种宿主特异性与链球菌的寄生宿主密切相关。这些蛋白酶通过特异性裂解宿主的IgG，有助于链球菌逃避免疫系统的识别和攻击，从而在特定宿主中成功地定殖和繁殖。

IgdE的N末端包含蛋白水解活性域，关键的催化三联体由一个半胱氨酸、一个组氨酸和一个天冬氨酸组成。在N端附近还包含一个转谷氨酰胺酶域（Transglutaminase domain），附近存在潜在的活性位点裂缝，催化三联体位于此区域附近。此外，IgdE的N端还包含一个信号肽序列，用于将其分泌到细胞外。C末端部分预测包含一个跨膜螺旋，可能有助于IgdE在细菌表面的锚定或与细胞膜的结合。

IgdE的独特结构使其能够特异性识别并裂解IgG的铰链区域。铰链区域的裂解发生在铰链区的半胱氨酸残基N末端，这些半胱氨酸残基可能形成IgG重链之间的共价二硫键。全长蛋白对于体外IgG切割不是必需的，因为由N末端470个氨基酸组成的截短IgdE蛋白保留了IgG切割活性。该蛋白质的C端部分的功能目前尚不清楚，但基于对IgdE C端部分预测的跨膜螺旋，以及与肺炎链球菌Cps2蛋白跨膜结构域的弱结构相似性，C端可能介导与细菌表面的关联。

S. suis IgdE的转谷氨酰胺酶域

（来源S. suis IgdE的AlphaFold2预测结构）

参考文献