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月亮
为了保障单克隆抗体药物在生命周期内的用药安全，有必要对其结构进行全面表征，以减少异质性、翻译后修饰（PTMs）及生产和储存过程中的质量变化带来的不良影响。根据ICH Q6B《质量标准：生物技术产品及生物制品的检验方法和接受标准》，单克隆抗体药物的结构表征应包括组分测定、物理性质，以及一级和高级结构的分析。
表征过程需从不同层面展开，涵盖完整蛋白、亚基及肽段水平的分析。在亚基水平分析中，采用高特异性且易于操作的IdeS蛋白酶能够大幅简化样品制备步骤，减少对设备的依赖，并缩短数据分析时间，为开发治疗性抗体的分析方法提供了有力支持。
IdeS蛋白酶
IdeS蛋白酶（Immunoglobulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes）是一种半胱氨酸蛋白酶，也称为Mac-1，是一种由化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes；S.pyogenes）分泌的细菌蛋白酶。该酶分泌时即为成熟形式，不需要进一步加工或激活即可发挥其蛋白酶活性。
IdeS蛋白酶对所有人类IgG亚类的铰链区均具有特异性，能够精确地在IgG重链铰链区下方的甘氨酸236位处切割，将IgG分解为F(ab′)₂和Fc/2片段。对于多数质谱（MS）分析，进一步的还原步骤（如使用TCEP或DTT处理）可以产生三个约25 kDa的片段：Fd、Fc/2和轻链Lc。
作为质谱表征前的关键样品处理步骤，IdeS蛋白酶能够有效简化复杂抗体样品的制备和数据分析过程，同时在质谱检测中可显著提升序列覆盖率和检测灵敏度。由于其高效性和特异性，IdeS蛋白酶非常适合高通量分析和标准化流程，现已广泛应用于抗体药物开发和生物分析领域，为深入了解抗体结构提供了强有力的工具。
IdeS蛋白酶底物切割示意图以及酶切位点
01
结构特征
IdeS蛋白酶因其特异性的蛋白水解活性而引起了广泛关注，其晶体结构已在1.9 Å分辨率下被解析，展示了典型的木瓜蛋白酶折叠结构，并具有显著的插入结构和独特的底物结合位点。此外，研究还表明，IdeS蛋白酶对 IgG的水解需要依赖于重链CH2域。
结构上，IdeS蛋白酶属于蛋白酶家族，具有典型的蛋白酶结构域。其活性中心由半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的催化三联体构成，活性位点由单个半胱氨酸残基形成，因此IdeS被归类为半胱氨酸蛋白酶。
X射线晶体学研究表明，IdeS蛋白酶具有一个紧凑的球形结构，内部形成一个深凹槽，该凹槽为酶的催化位点，特异性地与IgG的铰链区结合。通过这种特异性结合，IdeS蛋白酶能够特异性地降解宿主的IgG抗体，削弱宿主的免疫防御，从而在细菌的免疫逃避机制中扮演关键角色。
IdeS蛋白酶的催化三联体
02
作用模式
免疫球蛋白在人体免疫防御系统中发挥着至关重要的作用，它通过特异性识别外来微生物，并通过介导吞噬细胞或补体系统（或二者同时作用）来清除这些微生物。在这一过程中，细菌变得尤为脆弱，为了避开IgG的清除作用并延长存活时间，某些致病菌会进化出多种策略以抗衡IgG的干扰。
当机体识别到S. pyogenes感染时，IgG会与S. pyogenes表面的抗原特异性结合。在这种情况下，S.pyogenes通过一种免疫逃逸机制，即“去除Fc区和未结合的Fab区”，来避免被清除。S. pyogenes分泌的IdeS蛋白酶通过切割IgG的铰链区，去除抗体的Fc段，阻止免疫细胞识别和攻击细菌。此外，IdeS蛋白酶还可去除未与细菌表面抗原直接结合的Fab段，进一步减少了抗体在细菌周围的存在，有助于细菌避免被免疫系统识别。
此外，S. pyogenes还进化出了一种主要的机制。细菌表面会表达大量的Fc结合蛋白（M蛋白及类似M蛋白），这些蛋白与IgG Fc段具有高亲和力，并在细菌表面广泛存在。这样，细菌被血浆或炎性渗出液包围时，表面覆盖的Fc结合蛋白就可结合大量的IgG。接下来，S. pyogenes分泌的IdeS蛋白酶切割IgG的铰链区，去除抗体的Fab段。同时，M蛋白及类似M蛋白通过结合Fc段来抑制其功能。综上所述，两种机制均能使细菌有效避免免疫系统的识别和清除，从而增强其生存能力。
IdeS和IgG作用模式
03
催化步骤
体外实验表明IdeS蛋白酶对IgG的水解过程是按顺序进行的。在反应过程中，IdeS蛋白酶单体通过两个步骤将IgG分子切割为Fc和F(ab′)2片段。
首先，在第一阶段中，IdeS蛋白酶作用于IgG分子的一个重链，产生具有单一非共价结合的Fc链的单切割IgG分子（scIgG）。scIgG分子实际上是保留原始IgG分子的剩余重链的中间产物。在第二阶段中，该保留的重链被继续切割，导致释放出F(ab′)2片段和同二聚体Fc片段。这些产物在生理条件下通常可观察到。在还原条件下，F(ab′)2片段可以进一步解离成两个Fab片段，而同二聚体Fc则可以分解为单体。该酶的反应速度符合米氏动力学，分析显示首次单链水解的Km值为7.2 μM，kcat值为10.1 s⁻¹，第二次水解的Km值为28 μM，kcat值为0.10 s⁻¹。
IdeS蛋白酶切割IgG示意图
04
应用实例
IdeS蛋白酶能够快速、高通量地分析抗体产品，并且样品制备简单，避免了制备过程中引入的假象，便于数据解读。该酶已广泛应用于抗体关键质量属性（如糖基化、氧化、脱酰胺、异天冬氨酸化以及聚集等）的表征和分析流程。此外，还开发了用于评估抗体药物偶联物（ADC）关键属性的分析工作流程。
表征ADC药物
Brentuximab vedotin经IdeS蛋白酶裂解后，采用反相高效液相色谱（PR-MS）和亲水相互作用色谱与质谱联用（HILIC-MS）进行分析（图a）。通过该分析，确定Brentuximab vedotin的轻链含有1个药物载荷，Fd亚基含有1至3个药物载荷（图b）。此外，该方法还能够识别一些PTMs，如Fd'片段N端的谷氨酰胺焦谷氨酸及Fc区的糖基化修饰。
评估生物仿制药
通过电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱技术，在完整蛋白、亚基和肽段水平上对西妥昔单抗生物仿制药进行了结构表征。在完整蛋白层面，发现该抗体的轻链序列存在误差，缺少IgG1中常见的C端半胱氨酸，同时其分子量比原研产品低115 Da（图a）。进一步探讨差异，采用IdeS蛋白酶水解对西妥昔单抗进行亚基分析。对于每个Fc/2和Fd亚基，观察到两个峰，Fc/2显示出重链C端的赖氨酸剪切，而Fd则表现出糖基化异质性（存在唾液酸）（图b，图c）。同时，亚基的糖基化分析表明，共鉴定出 11 种CH2 N-糖基化的游离寡糖和20种不同的Fd N-糖基化聚糖，总共发现了24种不同的糖基化结构（图d）。
中和AAV抗体
在被动免疫静脉注射IgG（IVIg）的小鼠中，IdeS蛋白酶的裂解作用减少了抗AAV抗体并实现了有效的肝脏基因转移。同时，IdeS蛋白酶在体外减少了来自基因治疗试验参与者的血浆样本中的抗AAV抗体水平，这些结果为克服现有抗体以进行基于AAV的基因治疗提供了潜在的解决方案。
C端赖氨酸分析
在亚基水平上，使用液相色谱-质谱（LC-MS）技术对不同单克隆抗体（mAb）药物产品的结构一致性进行表征。结果显示，与美国FDA批准的产品相比，印度产品中出现了更多的电荷异构体。这是因为美国产品的C末端赖氨酸已被完全切除（图a，图b），而印度产品中则观察到部分赖氨酸被切除，部分赖氨酸保留（图c，图d），这进一步增加了印度产品的电荷异质性。
氧化分析
阿达木单抗通过IdeS蛋白酶酶解并经过化学还原后，得到约25 kDa的片段，这些片段通过反相液相色谱（LC）与在线电子转移解离（ETD）技术结合的混合Orbitrap傅里叶变换质谱仪（Orbitrap Elite FTMS）进行分析，该方法在检测IgG氧化位点方面具有高效性（图a）。氧化后的Fc区比未修饰的对照提前洗脱，这在总离子色谱图（TIC）中可以观察到（图b上）。同时，质谱图显示了氧化的Fc/2亚单位中单氧化和双氧化的存在（图b中）。在此基础上，氧化Fc的ETD Orbitrap FTMS 质谱图确认了氧化Met16位置的产物离子，氧化的Met位置通过箭头指示（图b下）。
糖化分析
抗体治疗药物的糖化可能在细胞培养生产过程中发生，主要原因是糖分子以非酶促方式附着在蛋白质的氨基上。此外，糖化还可能在后续的配方阶段、长期存储或临床给药过程中产生。通过使用IdeS蛋白酶裂解和LC-MS分析Fc/2片段，在静脉注射免疫球蛋白（IVIG）制剂的糖化稳定性研究中观察到了葡萄糖和麦芽糖的糖化现象。研究结果还表明，在高温（40°C）下，非还原性糖的反应性仍然较低。
异天冬氨酸分析
蛋白质中常见的一种PTMs是天冬氨酸（Asp）向异天冬氨酸（isoAsp）的异构化。在重组单克隆抗体类药物中，尤其是在互补决定区发生异构化时，可能会影响临床疗效。通过IdeS蛋白酶裂解，并结合疏水相互作用色谱（HIC）检测的方法，可以准确检测和定量抗体药物中的异天冬氨酸化，同时定位其具体位置（图a）。与肽图和聚焦肽图分析相比，该方法具有类似的结果趋势，但样品制备和数据分析的时间更短。
聚集体分析
不需要的高分子量物质（如二聚体）的形成是治疗性单克隆抗体制剂的重要质量属性。因此，深入理解mAb二聚化过程及对其二聚体的详细表征，对于药物开发至关重要。使用有限的蛋白水解是一种有效的方法，通过消耗不参与二聚化的片段，将相对复杂的mAb二聚体分子还原为较小的相互作用亚基。随后，通过电子显微成像技术对这些相互作用的亚基进行观察，可以更清晰地看到二聚化区域，尽管仍缺乏部分分子细节。
产品选择指南
参考文献
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