产品推介|名额有限!PNGase F 免费试用装限时申请!

文摘   2024-06-05 09:30   浙江  


产品介绍

Product Characteristics


蛋白质的糖基化修饰在生物学、疾病进展以及治疗性蛋白药物中均具有重要作用。在生物学中,糖基化修饰在细胞黏附、信号转导、细胞表面识别和免疫系统调节等方面发挥关键作用,维持生物体正常的生理功能。


此外,糖基化修饰还可作为癌症检测的生物标志物。在治疗性蛋白药物(如抗体、抗体偶联药物和融合蛋白)中,N-糖基化对药物在体内的识别、半衰期和免疫原性起着至关重要的作用,是治疗性蛋白药物关键的质量属性之一。因此,生产过程中需要对糖基化进行详细表征,综合分析糖基化也是监管要求的一部分,这对于确保获得正确的糖蛋白产品至关重要。


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N-糖基化简述


那我们所说的糖基化修饰究竟是什么呢?糖基化修饰是蛋白质翻译后的重要修饰之一,主要涉及碳水化合物与蛋白质的结合,通常发生在细胞的内质网和高尔基体中。


蛋白质中主要有两种糖基化形式:O-糖基化和N-糖基化。O-糖基化是糖基通过氧原子(O)与蛋白质中的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基的羟基连接。N-糖基化是将一种高甘露糖结构附着在天冬酰胺(N)残基上,形成一个特定的N-X-S/T序列,其中X可以是除脯氨酸(P)以外的任何氨基酸。这个序列在内质网和高尔基体中进一步修饰,形成复杂结构和杂合结构两种形式。


相比于O-糖基化,N-糖基化因其在调节蛋白质折叠、稳定性和功能方面的关键作用,成为研究的重点。


N-糖基化是抗体药物中普遍存在的一种糖基化形式,具有典型的核心五糖结构,包括两个N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine,GlcNAc)和三个甘露糖(Mannose,Man),缩写为Man(3)GlcNAc(2)。连接在核心五糖末端的常见单糖结构单元有岩藻糖(Fucose,Fuc)、半乳糖(Galactose,Gal)和N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)等。


上述提到N-糖基化修饰主要有三大类:高甘露糖结构、杂合结构和复杂结构。其中,高甘露糖结构仅包含与Man(3)GlcNAc(2)核心相连的甘露糖残基。杂合结构中,只有甘露糖残基与核心的α1,6臂相连,而其他糖则与核心的α1,3臂相连,单糖单位连接在与β1,2连接的GlcNAc残基上。复杂结构中,GlcNAc残基分别连接到核心结构的α1,6和α1,3甘露糖臂上,并通过这些GlcNAc残基进一步连接其他单糖。


在治疗性抗体药物中,复杂结构的N-糖链是最主要的聚糖类型。


N-糖基化聚糖的类型

N-糖基化的功能重要性


在常规治疗性抗体药物中,重链(Heavy Chain,Hc)Fc部分的CH2域中存在一个保守的N-糖基化位点,通常位于天冬酰胺297(Asn297)处,多数为复杂结构的N-糖链。此外,大约15%到20%的抗体分子在Fab区域也存在N-糖基化修饰(如:西妥昔单抗)。


治疗性抗体药物中的N-糖基化修饰种类繁多,并且极易受到宿主细胞类型和发酵条件(如培养基、pH值、温度等)的影响。因此,糖基化修饰通常表现出异质性,主要包括糖基化位点、糖基化程度以及糖链结构的差异。


N-糖基化修饰的多样性对全面、准确和高效地表征大分子抗体药物提出了重大挑战。那么,为什么表征抗体上的糖基化修饰如此重要呢?


这是因为糖基化在抗体的药代动力学、效应功能和安全性中扮演着关键角色。例如,糖基化能够稳定IgG的CH2结构域,而去糖基化会导致其稳定性下降,使其更容易展开或者聚集。


此外,不同抗体药物生产所采用的宿主不同,可能含有一部分的非人源单糖,这会增加产品的免疫原性,影响抗体的特异性识别。因此,对糖基化修饰进行详细的表征对于确保抗体药物的安全性和有效性至关重要。

不同聚糖对于IgG的影响

注:ADCC:抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用;

CDC:补体依赖的细胞毒作用



同时,美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)已经明确规定,生产商必须对原始药物的糖基化及其变异性进行检测和控制。此外,生物类似药物的生产也要求将糖基化水平控制在与原始药物一定范围内(不必完全相同),以获得上市授权。这一制度强调了在开发和生产原始药物及生物类似药物过程中进行系统和深入的糖基化分析的重要性。


在糖基化表征分析中,确保获得治疗性抗体药物准确的糖基化图谱,并通过去糖基化以更准确地描述抗体是至关重要的。


在这一过程中,需要采用高效、准确、稳定的去糖基化方法。目前,酶法去糖基化是一种被广泛采用且具有一定优势的方法。它利用特定酶的催化作用去除蛋白质分子上的糖基。这种方法具有高度选择性、操作温和和简单等优点。


不同的酶可针对特定类型的糖基进行去除,从而保持样品的完整性和活性。其中,PNGase F (N-糖苷酶 F)酶解是去除糖蛋白中几乎所有N-聚糖的最有效方法之一。

PNGase F


N-糖苷酶(peptide:N-glycanase,简称PNGase)是一类天冬酰胺酶,又称N-糖肽酶,存在于原核生物和真核生物中。它能够催化多肽链上的天冬酰胺残基连接的寡糖水解,将其转化为游离的聚糖。


PNGase最早于1977年在杏仁中被发现,随后陆续在大豆、水稻和原核生物中被发现。目前,原核生物中有两种主要类型的PNGase,即PNGase F和PNGase F-Ⅱ。PNGase F首次于1984年在脑膜炎败血伊丽莎白菌(Flavobacterium meningsepticum)中被发现并得名。


PNGase F,又称为肽-N-糖苷酶 F、N-糖肽酶 F、N-糖酰胺酶 F,是一种能够从糖肽和糖蛋白上完整切除N-连接寡糖的酰胺酶。其作用位点是N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基和天冬酞胺(N)之间的价键结构。


同时,它能够将天冬酰胺(N)转化为天冬氨酸(D),生成的氨基寡糖链随后水解成氨气和寡糖。PNGase F具有广泛的底物特异性,能够水解具有复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构的N-聚糖。然而,其对聚糖核心的修饰非常敏感。如果天冬酰胺(N)近端的GlcNAc上有α1-3岩藻糖连接,则会完全抑制PNGase F的活性,但α1-6岩藻糖连接则不受影响。


在结构上,PNGase F由两个紧密结合的全β结构域组成,这两个结构域通过分子底部的一段短loop连接。在分子顶部,多个延伸的loop从结构域2跨越并与结构域1相互作用。


每个结构域由一个八股反向平行的β桶组成,这两个结构域并排排列,使得β-片层的界面贯穿整个分子的长度。在两个结构域之间的界面形成了一个深裂缝,这个裂缝由β-片层之间的连接loop形成,包含多个酸性残基和芳香族残基。


活性位点位于两个结构域之间的裂缝中,关键催化残基包括D60、E206和E118。D60直接与底物的还原端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)残基的O1形成氢键,是主要的催化残基;E206通过桥接水分子稳定反应中间体;E118与底物的第二个N-乙酰葡萄糖胺残基的O6形成氢键,负责底物识别和结合。


N,N'-diacetylchitobiose与催化关键残基的结合模式

产品特点

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PNGase F切割底物示意图

(示例以RNase B为底物)


产品应用

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产品信息

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产品性能展示

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实力相当,同样强大


使用PNGase F进行糖链切割时,不论是在天然条件下还是变性条件下,能够轻松地处理复杂结构、杂合结构或高甘露糖结构的糖链


然而,产品目前无法切割具有α1-3核心岩藻糖结构的糖蛋白。选取Trastuzumab进行质谱分析时,经过37 °C处理1小时,完整的Trastuzumab成功去除了N-聚糖。

利用PNGase F进行糖蛋白去糖基化的关键特征

和SDS-PAGE分析


用PNGase F处理Trastuzumab的

TIC色谱图(左)和去卷积质谱图(右)


PNGase F酶活性与进口品牌相比毫不逊色,能够胜任各类N-糖链的酶切实验,确保实验的顺利进行和可靠结果的获得。

PNGase F的竞对品牌对比图


冻融不变,酶活稳定


液体PNGase F在无甘油缓冲液中能够在-20 ℃下稳定保存,经过16次反复冻融,酶活性依然能够保持不变,确保长期存储和多次使用时的实验效果始终如一。

常见问题

FAQs

参考文献

  1. Mimura Y, Katoh T, Saldova R, et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for  the safety, functionality and efficacy[J]. Protein & cell, 2018, 9(1): 47-62.


  2. Shrivastava A, Joshi S, Guttman A, et al. N-Glycosylation of monoclonal antibody therapeutics: A comprehensive review on significance and characterization[J]. Analytica Chimica Acta, 2022, 1209: 339828.


  3. 陈妍雯, 袁舒颖, 刘瑞杰, 等. N-糖蛋白去糖基化酶 (PNGase) 的研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展, 2022, 49(9): 1630-1637.


  4. Norris G E, Stillman T J, Anderson B F, et al. The three-dimensional structure of PNGase F, a glycosyl asparaginase from Flavobacterium meningosepticum[J]. Structure, 1994, 2(11): 1049-1059.


  5. Kuhn P, Guan C, Cui T, et al. Active site and oligosaccharide recognition residues of peptide-N4-(N-acetyl-β-d-glucosaminyl) asparagine amidase F[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(49): 29493-29497.


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杭州力文所生物科技有限公司成立于2021年9月,是一家通过AI算法驱动进行蛋白质设计的科技型企业。公司专注于对蛋白质共进化的规律与“人工智能算法+湿实验验证”项目的研究,结合人工智能,让AI蛋白设计实现工业化落地,赋予蛋白质更广阔的生产生活场景应用。


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