稿件来源
雅克
01
介绍
近日，力文所与中国农业科学院涂涛课题组的合作研究取得重大进展，于advanced science 上发表了一篇关于蛋白质热稳定性改造的论文。
蛋白质作为生物催化剂，广泛应用于工业和生物技术领域，然而其天然的热稳定性常成为其功能发挥的限制因素。提高酶的热稳定性是蛋白质工程中的关键问题之一。尽管现有的蛋白质设计工具和深度学习技术取得了一定的进展，工程化不稳定酶的热稳定性仍充满挑战。
在此背景下，本研究提出了“短板理论”并结合了“零样本哈密顿模型”，以提高酶的热稳定性。该模型特别适用于那些结构中存在明显热不稳定区域（即短板）的酶，通过修复这些短板，显著提高酶的稳定性。
02
背景
蛋白质设计工具日新月异，如何针对特定的动态特性（如热稳定性）进行工程化仍是一个难题。
传统的蛋白质设计方法包括理性设计、定向进化等，一般通过生成多种突变库以找到合适的突变从而增强酶的热稳定性。最新的计算技术如AlphaFold、RFdiffusion、ESM3则通过大数据降低了对湿实验的依赖，在荧光酶、纳米抗体以及binder的设计优化上均有优异表现，这些计算方法大大提高了我们对蛋白质结构和设计的理解。
然而，准确预测突变对蛋白质热稳定性的影响仍然非常具有挑战性。这是因为突变效果依赖于目标区域在热失活过程中对蛋白质解折叠的贡献。找到这些区域和突变，通过多种方法改进热稳定性，不仅能延长酶使用寿命，还可以提高反应效率，减少反应过程中使用的酶量。
03
方法
本研究提出了一种新颖的“短板理论”，并结合了基于大模型的“零样本哈密顿模型”（Zero-Shot Hamiltonian）来优化酶的热稳定性。
“短板理论”是本研究提出的一个核心概念。
它将蛋白质的结构类比为由不同长度的木板构成的桶，而其中最短的那块木板决定了桶的最大容量。在蛋白质设计的背景下，这意味着酶的整体热稳定性通常取决于其结构中最不稳定的部分，这些不稳定的部分可以是结构域，也可以是残基或者原子。通过识别和修复这些“短板”，可以大幅提升酶的稳定性。
为验证这一理论，研究者选用了α-淀粉酶作为模型酶，因为这种酶在工业应用中广泛使用，并且其结构和热稳定性已有大量数据积累。研究通过多层次的结构比对分析发现，不同酶之间的最大差异在B结构域，且其中包含不少影响热稳定性的残基突变，在结构域和残基层次上都说明其可能是最不稳定的短板。为了验证短板，作者通过基因工程方法将热稳定型α-淀粉酶（ThermoAMY）和常温型α-淀粉酶（mesoAMY）的B结构域进行交换，生成两个嵌合体，分别命名为“mesoAMY-B”和“thermoAMY-B”。最后测量这些嵌合体的Tm值，以此评估其热稳定性变化。
为了验证短板，作者将热稳定型α-淀粉酶（ThermoAMY）和常温型α-淀粉酶（mesoAMY）的B结构域进行交换，通过基因工程方法，将常温型和热稳定型α-淀粉酶的B结构域替换，生成两个嵌合体，分别命名为“mesoAMY-B”和“thermoAMY-B”。最后测量这些嵌合体的Tm值，以此评估其热稳定性变化。
在修复了蛋白质的短板后，作者进一步利用“零样本哈密顿模型”对突变位点进行筛选，尝试通过突变进一步提升酶的热稳定性。
该模型来自NLP，结合了蛋白质同源序列中的共进化信息和大模型，能够在没有专门热稳定性训练数据的情况下预测突变点对酶热稳定性的潜在影响。模型的具体流程如下：
同源序列比对：使用HHblits等工具从数据库中提取α-淀粉酶的同源序列，生成多重序列比对。
共进化分析：利用多序列比对数据，通过MSA Transformer模型生成接触图，预测蛋白质结构中残基之间的相互作用。
双突扫描：在识别出的残基对中，针对可能具有高相互作用的残基进行双突变扫描，生成所有可能的双突变组合，并对每个组合计算其哈密顿量，作为热稳定性的一个评估指标。
突变筛选：根据计算出的哈密顿量，对突变组合进行排序，选择哈密顿量最低的突变组合作为优先实验验证对象。
04
结果
研究人员测试了不同温度下的酶活和热稳定性，实验结果显示，mesoAMY-B的Tm显著提高了12°C，表明修复了B结构域后，常温型酶的热稳定性得到了大幅提升。同时，thermoAMY-B的Tm值反而下降，这说明在热稳定型酶中引入不稳定的B结构域会降低其热稳定性。
这一结果验证了短板效应：蛋白质中的短板确实决定了其整体稳定性。
酶活检测中也观察到了类似的情况，55度时mesoAMY-B的相对酶活为24.1%，而未经过修复的常温型酶仅为11.3%。mesoAMY-B在60°C和65°C下的残留活性分别为64.8%和21.4%，而常温型酶在同样条件下表现出完全失活。这表明修复后的常温型酶不仅在高温下更为稳定，而且保持了较高的酶活。
此外，基于Ca²⁺的存在对α-淀粉酶很重要的先验，研究者也分析了Ca²⁺的影响。结果显示Ca²⁺极其重要，它的缺失导致mesoAMY-B的热稳定性和酶活都大幅下降，但是mesoAMY却几乎不受影响。这一定程度证明了常温型酶稳定性低的原因就在于B-结构域，更具体说，它无法有效利用Ca²⁺。
上图显示了来自零样本哈密顿模型选择的17个实验可表达突变的热稳定性和相对酶活。实验结果显示大部分突变体在修复后的mesoAMY-B中表现出显著的稳定性提升，多个突变体在55°C时的相对活性均超过了50%。在引入Ca²⁺后，12个突变体的Tm值提升超过0.5°C，最显著的F237R/S240G突变体的Tm值总体提升了8.5°C。相较之下，未修复的常温型酶突变体仅有少数显示出Tm的轻微提升。这些结果表明，修复短板后的突变可以显著增强酶的热稳定性。
上述实验结果也可以从结构和MSA中得到对应。对于F237R/S240G突变，可以观察到α螺旋内G240和S236的之间氢键增加，二级结构更加稳定，突变的接触图中也显示了残基240和236之间的新相互作用。
本研究通过短板修复和零样本哈密顿模型的结合，成功实现了α-淀粉酶热稳定性的显著提升。研究结果表明，修复蛋白质中的短板不仅能提高其热稳定性，还能显著改善其突变效果，展示了短板修复和大模型在酶工程中的巨大潜力。
05
力评
本研究通过提出“短板理论”并结合“零样本哈密顿模型”，为酶热稳定性设计提供了一个全新的思路。这一理论强调了在设计高稳定性酶时，识别并修复其结构中的短板是至关重要的。特别是在多域蛋白质中，修复短板后，再进行突变筛选，可以显著提高突变的效果。实验结果验证了这一策略的有效性，并展示了“零样本哈密顿模型”在蛋白质设计中的应用潜力。
未来，随着大模型和蛋白质设计工具的不断发展，我们有望在更大范围内实现蛋白质功能的精确控制和优化，为生物技术和工业应用带来更多的创新。
文献链接：
M. Liao, S. Feng, X. Liu, G. Xu, S. Li, Y. Bai, H. Luo, B. Yao, H. Wang, T. Tu, Novel Insights into Enzymatic Thermostability: The “Short Board” Theory and Zero-Shot Hamiltonian Model. Adv. Sci. 2024, 2402441.
https://doi.org/10.1002/advs.202402441
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