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月亮
在临床应用中，大多数重组治疗性蛋白药物是糖基化蛋白。糖基化修饰是此类产品的重要质量属性之一，它的组成会直接影响蛋白质的折叠、稳定性、溶解性以及细胞内的转运过程。抗体类药物是重组治疗性蛋白中最广泛应用且市场份额最大的类别，其糖基化修饰不仅对结构稳定性和药代动力学有显著影响，还可能直接关系到药物的临床疗效。
糖基化修饰包括N-糖基化和O-糖基化，两者都具有复杂性。相比于没有固定核心结构且更为复杂的O-糖基化，N-糖基化虽然复杂，但有明确的规律性，是抗体类药物中最常见且研究最多的糖基化修饰类型。由于聚糖结构的复杂性，在抗体药物的研发和生产过程中，对聚糖结构的深入表征和分析是确保药物质量和疗效的重要环节之一。
N-糖基化修饰的表征可以从四个结构层次进行分析，包括完整蛋白、亚基水平、消化的肽段以及酶切释放的游离聚糖。在每种策略中，分析物的构象（如完整形式、还原形式、消化后的肽段或释放的聚糖）都会显著影响所获得信息的深度和准确性。这些方法通常结合使用，以确定聚糖谱、聚糖结构及其异质性、糖基化位点以及特定聚糖的含量。
糖基化分析工作的不同阶段
不同水平分析抗体聚糖结构示意图
完整蛋白水平
在完整糖蛋白形式下，分析物以其最大构象（质量）存在，即完整的糖蛋白结构。这种方法是一种快速表征糖链异质性的有效手段，能够识别主要的糖链类型。样品制备相对简单，通常包括缓冲液更换、液相色谱分离和质谱分析。尽管该方法可以识别和表征最常见的糖链类型，但无法提供精确的糖链结构信息。
亚基水平
糖蛋白的亚基分析包括还原、消化或消化加还原的样品处理方法。在蛋白酶消化和/或还原分析中，完整的单克隆抗体在有或无还原条件下与蛋白酶反应，生成带有链内或链间二硫键的消化产物，或单独的重链（Hc）和轻链（Lc）亚基，随后通过质谱分析获取各片段的分子信息、糖型及其含量数据。在还原条件下，生成的分析物结构较小，有助于简化完整蛋白中复杂的糖链结构。
在蛋白酶消化过程中，与非特异性蛋白酶相比，使用特异性IgG蛋白酶能显著提升反应速度和特异性，从而改进亚基水平的分析效果。
IdeS/IdeZ蛋白酶
IdeS和IdeZ蛋白酶能够在铰链区域下方的特定序列位点进行特异性切割，生成(Fab')2和Fc/2片段，再经过还原可生成25 kDa左右的LC，Fd和Fc/2片段。IdeS和IdeZ蛋白酶在底物适应性方面存在差异，IdeS蛋白酶更适用于切割人类IgG，而IdeZ蛋白酶则更适用于切割小鼠IgG2a和IgG3。
IdeS/IdeZ蛋白酶切割IgG示意图
IgdE蛋白酶
IgdE蛋白酶能够在抗体铰链区域上方的特定位点进行切割，生成Fc片段和两个Fab片段。在经过还原处理后，Lc和Hc之间以及Hc和Hc之间的连接断开，形成各自的单链片段（Lc、Fd、Fc/2）。IgdE蛋白酶对人源IgG1具有高度特异性。该酶有助于表征双特异性和多特异性抗体，以及分析完整和成对Fc糖基化。
IgdE蛋白酶切割IgG示意图
糖肽水平
当抗体含有多个糖基化位点时，肽图分析通常具有明显优势。通过使用多种蛋白酶（如如胰蛋白酶、Glu-C、Lys-C等）的组合，将抗体酶解为大小在0.5至5 kDa之间的糖肽进行分析。由于酶解后的糖肽仍存在一定的异质性（如糖基变体的连接方式和位点占有率），可以通过高效液相色谱或凝集素亲和色谱对糖肽进行富集，从而提高检测灵敏度，随后再进行质谱分析。通过单次糖肽水平的实验，可以同时实现定性和定量，获取糖肽的氨基酸序列、糖基化修饰位点及糖型等信息。
胰蛋白酶
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，是酶切消化中最常用的蛋白酶。它能够在赖氨酸或精氨酸的C端进行切割，但对赖氨酸残基的切割效率低于精氨酸。由于其高效性、强特异性、广泛的可用性、操作简便以及相对较低的成本，胰蛋白酶被认为是蛋白质组学中肽段水平表征的金标准。
Glu-C
Glu-C蛋白酶因其切割位点较少，生成的肽段比胰蛋白酶更长，常与其他蛋白酶联合使用，以研究蛋白质的翻译后修饰，增加蛋白质组的覆盖率并提高鉴定率。该酶的切割特异性受pH值和缓冲液组成的影响。在pH 4时，Glu-C优先切割谷氨酸的C端，而在pH 8时，它还会切割天冬氨酸的C端。
Lys-C
Lys-C蛋白酶切割赖氨酸的C端，具有高效且强特异性的特点，通常用于弥补胰蛋白酶对赖氨酸切割效率较低的不足。然而，Lys-C单独生成的肽段与胰蛋白酶生成的肽段存在显著重叠，因此在整体蛋白质序列覆盖率方面不会显著增加。
游离糖水平
与上述表征方法相比，游离糖的样品制备相对复杂。通常使用N-糖苷酶来释放糖蛋白上的N-聚糖。然后使用荧光基团对游离的糖苷进行衍生化处理，赋予寡糖发色或荧光的特性。标记后的糖链可以通过亲水作用色谱（HILIC）或毛细管电泳（CE）进行分离。随后，通过荧光检测器（FLD）检测荧光信号并进行定量分析，也可以串联质谱检测器（MS）进行定性分析。
PNGase F
PNGase F是一种能够从糖肽和糖蛋白上完整切除N-连接寡糖的酰胺酶。其作用位点是N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）残基和天冬酞胺（N）之间的价键结构。同时，它能够将天冬酰胺（N）转化为天冬氨酸（D），生成的氨基寡糖链随后水解成氨气和寡糖。
PNGase F具有广泛的底物特异性，能够水解具有复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构的N-聚糖。然而，其对聚糖核心的修饰非常敏感。如果天冬酰胺（N）近端的GlcNAc上有α1-3岩藻糖连接，则会完全抑制PNGase F的活性，但α1-6岩藻糖连接则不受影响。
PNGase F切割底物示意图
Endo S2
内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Endo S2）是一种内切糖苷酶，能够切割N-糖链结构中两个GlcNAc之间的β-1,4糖苷键，同时保留与Asn相连的一个GlcNAc。该酶能够水解存在于Fc N-糖基化位点的所有糖型。此外，Endo S2对所有人类IgG亚类及许多不同物种的IgG均具有活性。该酶可用于降低基于抗体的治疗药物的复杂性，或用于研究核心去岩藻糖基化和N-糖基化位点的占有情况。
Endo S2切割底物示意图
α2-3,6,8 唾液酸酶
α2-3,6,8 唾液酸酶是一种专一催化特定糖苷键断裂的酶，包括α2-3、α2-6和α2-8键，其功能在于释放糖蛋白、糖脂和多糖等底物直链或支链非还原末端的唾液酸残基。唾液酸残基的释放速率按照α2-3键 > α2-6和α2-8键的顺序排列，水解α2-6和α2-8键的速度相近。该酶主要应用于聚糖结构分析、复杂性样品降解、电荷异质性分析、治疗性重组蛋白的结构分析以及异常唾液酸化的鉴定及体外诊断等领域。
α2-3,6,8 唾液酸酶切割底物示意图
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参考文献
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