【发酵工艺】有害菌防控-发酵染菌检测方法及技术手段
学术
工业农业
2024-07-14 18:34
北京
染菌与控制是发酵圈永远绕不开的话题。降低染菌率是每一个发酵人应该认真学习和考虑的问题。而有效的检测和判断手段是我们发现染菌的前提。
染菌判断是我们在发酵过程中首先面临的问题，我们怎么知道发酵系统染菌了？什么时候染菌的？染菌到什么程度了？越是早发现，对事故处理越是有利。一切异于常规规律的状态都可能意味着染菌。对于发酵工艺已经稳定的品种，要明察秋毫，对于新品种或者工艺正在调整的品种要抓主要规律。
纯种培养和发酵，在外界条件（种子培养情况，接种量，通气，温度，培养基，补料等）一定的情况下，发酵系统是趋于稳定的。比如溶氧，pH变化（酸碱消耗速度），补料消耗速度，蛋白某时刻的表达量等参数的变化规律。因此如果这些我们常规见到的一些参数出现了异常，那么我们就要考虑染菌的可能性。摇瓶条件下是非常难以判断种子是否染菌的，所以在做摇瓶种子液是最好能加入一定量的抗生素，以减少染菌的可能性。但是我们还是要对其中的非常明显的异常情况多加留意：培养液出现异常，比如出现不应该有的结块，出现不应该有的菌丝，颜色有明显的异常，外测pH异常，生物量跟踪监测发现异常等。不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。在发酵罐培养过程中，我们会定时取样，测定其生物量。在我们工艺稳定的情况下，固定发酵时间的生物量是趋于稳定在一个范围的，如果发现生物量出现较大的偏差，在排除其他条件的影响的情况下，就要考虑染菌的可能性。比如大肠杆菌在培养的时候出现生物量极具下降，那么染噬菌体的可能性就非常大。pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常变化就意味着发酵的异常，比如我们在做大肠杆菌发酵的过程中采取pH反馈补料的时候，发现补料速度变慢，那么就有可能是出现了染菌的情况。发酵系统溶氧的变化是非常灵敏的，我们在常规的发酵程序中，溶氧都是在固定的时间降低到某个值，同样，如果我们利用溶氧做反馈控制，就反应到物料的补加速度上。对于特定的发酵过程要求一定的溶解氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵染菌发生的表现。在正常的发酵过程中，发酵初期菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，在这阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧又再度上升；当感染噬菌体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶解氧的变化比菌体浓度更灵敏，能更好地预见染菌的发生。由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。不同的微生物呼吸代谢途径会有差异，因此尾气中二氧化碳或者氧气的成分会有差异，当尾气中的成分浓度发生改变，也要注意是否染菌。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中C02含量的变化是规律的。染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中C02含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，C02含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，C02含量减少。因此，可根据C02含量的异常变化来判断是否染菌。一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。当发酵后期染噬菌体后，噬菌体会导致细胞裂解，蛋白释放，从而导致泡沫突然增加。不同的菌株、生产不同的产品发酵液的味道是不一样的，经验丰富的员工可以通过味道的异常来警示发酵系统染菌。宏观判断不需要借助特殊的设备和一起，仅有到发酵常配的检测设备，但是宏观判断并不能确定是否染菌，需要进一步借助微观方法来给出结论。染色方法分为很多种，我们常用的就是单染色法和革兰氏染色，可以满足我们常规的镜检判断要求，当然，如果有必要的时候可以进行鞭毛染色和芽孢染色。染色我们看什么？①菌体形态，是否有异于生产菌株的形态，比如我们生产菌株是酵母菌，而视野中有杆菌，哪怕就那么一个。我们的生产菌株是芽孢杆菌，而视野中出现了球菌.我们生产菌株是丝状菌，但是我们视野中有其他类型的菌。②菌体状态，菌体经过染色后是否饱满，如果染色很浅，或者发现视野有明显碎片，那么就要考虑噬菌体的可能性。③正常的异常情况，比如枯草芽孢杆菌在快速增值时，会在视野中出现长链状，这并不一定是染菌。将待测样品在无菌平板上划线，分别于37℃和27℃进行培培养，一般24h后即可进行镜检观察，检査是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可将需要检査的样品先置于37℃培养6h,使杂菌迅速増殖后再划线培养。噬菌体平板检测法：采用双层平板法、滤纸片法、点样法等。- 平板划线和肉汤培养要做至少三个重复，并且连续做三次，以排除人为操作误差。如果连续三次出现浑浊或者变色可以确定染菌
总原则：科学合理的选择检查工序和时间，避免下道工序再遭到污染。取样方法和设备要科学合理，避免操作染菌。分工序和分时间进行取样检查。具体时间安排可参考下表：
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