注射用甲苯磺酸奥马环素无菌检查抗菌活性的去除及验证

注射用甲苯磺酸奥马环素的主要成分是甲苯磺酸奥马环素。甲苯磺酸奥玛环素是一种新型的广谱抗生素，属于环素类抗生素家族。它通过抑制细菌蛋白质的合成来发挥抗菌作用。甲苯磺酸奥玛环素的结构稳定，不易被细菌产生的酶类破坏，因此能够有效应对一些对常规抗生素产生耐药性的细菌。甲苯磺酸奥玛环素的抗菌活性广泛且强大，尤其是对多重耐药菌的抑制作用显著。它对多种常见的致病菌，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等，均显示出良好的抗菌效果。此外，甲苯磺酸奥玛环素还能够有效应对一些对其他抗生素产生耐药性的细菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等。

甲苯磺酸奥马环素是一种有机化合物，分子式为 C₂₉H₄₀N₄O₇ · C₇H₈O₃S，是一种医药原料药，是白色至黄色的固体，能溶于二甲基亚砜。

中国药典 四部 1105 表2 常见干扰物的中和剂或灭活方法中喹诺酮类抗生素可选用的中和剂为镁或钙离子^[1]。王静^[2]等人在抗生素类药品无菌检查方法的研究进展中就薄膜过滤法中的冲洗选用了卵磷脂和吐温、 二价金属离子（如镁离子、钙离子和锰离子等）作为中和剂中和抗生素类药品的抑菌性。邹晓平^[3]等人在头孢西丁钠无菌检查消除抑菌性的研究中加入 β- 内酰胺酶来消除头孢西丁钠的抑菌活性。刘健^[4] 等人在无菌检查时消除美罗培南的抑菌性一文中采用加大人工振荡和增加冲洗次数的薄膜过滤法消除美罗培南的抑菌性。王君^[5]等人在 β- 环糊精溶液在注射用德拉沙星无菌检查中的应用中联合使用了β- 环糊精溶液和无菌氯化镁溶液，消除德拉沙星的抑菌作用。

消除供试品的抑菌活性是无菌测试方法验证中的难点。供试液接种后，按规定的方法进行培养。与对照管比较，如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需要采用适宜的方法消除供试品的抑菌活性。对于具有抑菌活性的供试品，为了消除供试品的抑菌性应尽量选择操作简便、快速的方法，同时所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌活性比较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法^[1]。

无菌检查中消除抑菌活性的方法有：稀释法、薄膜过滤法、加入适宜的中和剂或灭活剂，对于抑菌性强的供试品，可联合使用上述方法去除抗菌活性。

文中所用培养基参照 2020 年版1101 无菌检查中关于培养基的要求进行无菌性和灵敏度检查，结果均符合规定。所用菌株均为采购的 3 代商业定量菌株。

表1 样品信息

表2 试验中的仪器设备

表3 试验中的耗材

表5 试验中的菌株

按照《中国药典》2020 年版，该样品的批产量大于 500 瓶，每瓶的装 100 mg。按《中国药典》2020 年版四部通则 1101 无菌检查法，供试品接种每种培养基的最少检验数量为 20 瓶，每瓶供试品接入每种培养基的最少检验量为 50 mg。

由于注射用甲苯磺酸奥马环素的抑菌性较强，为了节约样品，使用 1 支样品进行小试，小试成功后再进行放大试验。

2.3.1 预试验一

2.3.1.1. 取 1 支样品，用 3 mL（含0.1% 吐温 80）的 0.1% 无菌蛋白胨水溶液溶解，转移至（含 0.1% 吐温 80）的 0.1% 无菌蛋白胨水溶液至 100 mL。

2.3.1.2. 先用适量的冲洗液冲洗集菌器滤膜，使滤膜润湿。将上述样品溶液过滤。用500 mL（含0.1%吐温80）的0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 100 mL。在最后一次使用的冲洗液中加入不大于 100 cfu 的金黄色葡萄球菌，进行过滤。过滤结束后，泵入100 mL 的硫乙醇酸盐流体培养基。

2.3.1.3. 用缓冲液代替供试品，操作同 2.3.1.2.。

2.3.1.4. 试验结果：试验组无菌生长，菌液组生长良好。

2.3.2 预试验二

2.3.2.1. 取 1 支样品，用 3 mL 无菌水复溶，加入一支 Ca(OH)₂ 缓冲液，混匀，转移至 100 mL pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液中，制得供试液。

2.3.2.2. 先用适量的冲洗液冲洗集菌器滤膜，使滤膜润湿。将上述样品溶液过滤。用 300 mL pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为100 mL。在最后一次冲洗液中加入不大于 100 cfu 的金黄色葡萄球菌，过滤。过滤结束后，泵入 100 mL 的硫乙醇酸盐流体培养基。

2.3.2.3. 用缓冲液代替供试品，操作同 2.3.2.2。

2.3.2.4. 试验结果：试验组较菌液组生长缓慢，第 3 天时长势接近。证明Ca(OH)₂ 对消除样品中的抑菌性有一定的作用。

2.3.3 预试验三

2.3.3.1. 取 2 支样品，一支用 0.6 mL的（含 0.1 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3%吐温 80）的 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液溶解，一支用 3 mL 的（含 0.1 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液溶解，混匀，过滤。

2.3.3.2. 先用适量的冲洗液冲洗集菌器滤膜，使滤膜润湿。将上述样品溶液过滤。用 900 mL（含 0.1 组氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液溶解冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 100 mL。在最后一次使用的冲洗液中加入不大于 100 cfu 的金黄色葡萄球菌，进行过滤。过滤结束后，泵入 100 mL 的硫乙醇酸盐流体培养基。

2.3.3.3. 用缓冲液代替供试品，操作同 2.3.2.2。

2.3.3.4. 试验结果：与菌液对照组相比，试验组生长缓慢，在第 3 天时长势接近菌液组。结果观察中发现用 3 mL溶解液复溶样品的试验组较用 0.6 mL溶解液复溶样品的试验组生长更好。证明缓冲液中所加的 0.1 组氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐温 80 对消除样品中的抑菌性有一定的作用。

2.3.4 预试验四

考虑到 Ca(OH)₂ 和 0.1 组氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐温 80 对消除样品的抑菌性都具有一定的作用，但分别使用时效果不明显，以上两种方式联合使用。

2.3.4.1. 取1支样品，pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液溶解，加入一支Ca(OH)₂ 缓冲液，混匀，制得供试液。

2.3.4.2. 先用适量的冲洗液冲洗集菌器滤膜，使滤膜润湿。将上述样品溶液过滤。用 900 mL（含 0.1 组氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 100 mL。在最后一次使用的冲洗液中加入不大于100 cfu的金黄色葡萄球菌。

2.3.4.3. 用缓冲液代替供试品，操作同 2.3.4.2。

2.3.4.4. 试验结果：与菌液对照组相比较，试验组生长良好。

2.3.5 预试验五：放大开发

2.3.5.1. 取 10 支样品，每支用 5 mL饱和的 Ca(OH)₂ 水溶液溶解，混匀，振荡，合并溶解液至 100 mL pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液中，制得供试液。

2.3.5.2. 先用适量的冲洗液冲洗集菌器滤膜，使滤膜润湿。将上述样品溶液过滤。用 500 mL（含 0.1 组氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 100 mL。在最后一次使用的冲洗液中加入不大于 100 cfu 的金黄色葡萄葡萄球菌。

2.3.5.3. 用缓冲液代替供试品，操作同 2.3.5.2。

2.3.5.4. 试验结果：与菌液对照组相比较，试验组虽有菌生长，但生长缓慢且微弱。

2.3.6 预试验六

考虑到饱和的 Ca(OH)₂ 在 0℃时的溶解度是 0.18 g，溶解度较小，更换为硫酸镁溶液继续放大开发。

2.3.6.1. 取 10 支样品，每支用 5 mL1 mol · L^-1 的 MgSO₄ 水溶液溶解，混匀，振荡，合并溶解液至 100 mL pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液中，制得供试液。

2.3.6.2. 先用适量的冲洗液冲洗集菌器滤膜，使滤膜润湿。将上述样品溶液过滤。用 500 mL（含 0.1 组氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 100 mL。在最后一次使用的冲洗液中加入不大于 100 cfu 的金黄色葡萄葡萄球菌。

2.3.6.3. 用缓冲液代替供试品，操作同 2.3.6.2。

2.3.6.4. 试验结果：与菌液对照组相比，试验组生长良好。

2.3.7 结论

通过以上6组预实验，证明用1 mol · L^-1 的 MgSO₄ 与（含 0.1 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，以上两者联用，可以消除注射用甲苯奥马环素的抑菌性。为了使样品中 1 mol · L^-1 的MgSO₄ 的含量更多，试验组能更好的生长且对微生物无毒，在不改变 MgSO₄ 浓度条件下，对硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基进行预处理。

3.3.2. 将制备好的供试品溶液过滤，再用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（含0.1% 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温80）冲洗，分 5 次，每次 100 mL。在最后一次的冲洗液中加入 0.1 mL 的10² ～ 10³ cfu/mL 金黄色葡萄球菌（不大于 100 cfu），过滤。同法，试验菌换成大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，过滤。

3.3.3. 过滤完成后，加培养基至滤筒内，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭菌的滤筒内加入 100 mLFTM，接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的滤筒内加入 100 mL TSB。

3.5.2. 用缓冲液代替供试液过滤，再用 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液（含0.1% 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温80）冲洗，分 5 次，每次 100 mL。同法共制备 2 支无菌检测筒。

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和生孢梭菌计数 TSA 于30 ～ 35℃培养不超过 3 天；白色念珠菌和黑曲霉计数 TSA 于 30 ～ 35℃培养不超过 5 天。

生孢梭菌使用厌氧产气袋和厌氧指示剂置于培养箱中厌氧培养，其他试验菌在培养箱中需氧培养。

注射用甲苯磺酸奥马环素的无菌检查方法学验证，采用薄膜过滤法，对1 批次注射用甲苯磺酸奥马环素进行 3次独立无菌验证，检验量为半量。3 次试验结果均为阴性对照组无菌生长；阳性对照组各试验菌生长良好；与阳性对照组比较，试验组各试验菌生长良好；各试验菌菌液计数平均菌落数均不大于100 cfu/ 皿，符合要求。无菌检查方法适用性试验结果详见表 6、表 7、表 8。

表6 第一次无菌检查方法适用性试验结果

使用 1 mol · L^-1 的 MgSO₄ 溶解样品，薄膜过滤后，再用 500 mL（含 0.1 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温 80）的 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，在泵入的100 mL FTM 和 TSB 中各加入 10 mL 的1 mol · L^-1 的 MgSO₄ 混匀，此方法可以有效地消除注射用甲苯奥马环素的抑菌性并用于注射用甲苯奥马环素的无菌验证。