生物反应器培养动物细胞在病毒疫苗生产中的应用

改进病毒规模化生产效率，优化疫苗生产工艺是病毒疫苗研制的关键环节。目前，国内动物细胞制备病毒疫苗的操作方式逐渐从转瓶培养向生物反应器培养转变。生物反应器培养动物细胞的常见方法有悬浮培养、微载体培养、片状载体培养等。生物反应器培养动物细胞有很多优势，可扩大病毒产量，降低成本，易于获取稳定性强、免疫原性高的病毒，有助于机械化控制。生物反应器有潮汐式生物反应器、一次性摇动式生物反应器、一次性填充床生物反应器、微小型生物反应器、新型固定床生物反应器，不同的反应器有不同的特点。对生物反应器培养动物细胞技术在病毒疫苗生产应用领域的研究进行综述，为促进生物反应器的开发与研究提供参考。

疫苗接种是预防流行性疾病的有力武器。目前，国内动物细胞制备病毒疫苗的操作方式逐渐从转瓶培养向生物反应器培养转变，后者因其成本低廉、生产效率高、生产规模大而备受关注^［1］。但我国生物反应器动物细胞培养技术的发展水平与先进国家相比，仍存在较大差距^［2］。应用创新型生物反应器大规模培养动物细胞无疑成为加快疫苗类产品研发的关键，在整个疫苗生产链中将起到重要作用。

参照细胞在贴壁与悬浮培养上的差异特性，应用生物反应器动物细胞培养技术多涵盖悬浮培养、微载体培养、片状载体培养等方法^［2］。

悬浮培养条件单一且具备良好的传质、传氧效果，借助装置振动使细胞处于分散状态，多用于单细胞及微小细胞团的系统培养。刘萍等^［3］利用此技术生产细胞源禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 灭活疫苗，选取一株来源清晰的贴壁犬肾细胞(MDCK) 以贴壁与悬浮两种方式进行培养，并采用免疫血清学法，针对细胞源、鸡胚源不同来源的病毒制备灭活疫苗并进行评价，结果表明，MDCK 细胞悬浮液培养 48h，细胞密度约为每毫升 3.0×10⁶个，与贴壁细胞培养相比，细胞形态结构清晰，具有较高的细胞活力，且疫苗免疫效果与鸡胚疫苗相近，易实现稳定增殖。王笑天等^［4］以贴壁与无血清悬浮两种培养方式比较被乙型流感病毒感染的 MDCK细胞的增殖情况，在无血清悬浮培养下，流感病毒于MDCK 细胞增殖产生的 HA 血凝滴度更高，为采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。悬浮培养技术在猪圆环疫苗生产中的应用表明，细胞悬浮培养相比于贴壁培养技术在疫苗生产中具备更明显的应用优势与更强的免疫原性^［5］。现阶段，以生物反应器为基础的细胞悬浮培养技术平台正逐步建立与完善，合理的设计思路与突破的革新方法，可促使该平台在推动疫苗规模化生产上发挥积极作用。

微载体主要通过为细胞提供贴附接触面积的方式实现细胞的生长繁殖。微载体因体积小、比重轻等独特优点，在无外界或轻度外力的搅拌和影响下，能完全自由均匀地分布在整个固体培养基内。该材料生物相容性高、制备简单、可反复多次使用，降低了动物细胞培养的生产成本。华涛等^［6］采用生物反应器微载体悬浮培养 PK15 细胞，以感染复数为 0.1 的接毒比例微载体培养三代后，所得病毒液效价可达 10^7.25 TCID₅₀/mL，为工业化的规模生产提供了有效的数据支撑。王昊等^［7］利用微载体悬浮培养接种猪细小病毒 L 的猪睾丸传代细胞系( ST 细胞) ，经二乙烯亚胺( BEI) 溶液灭活、浓缩等步骤制备灭活疫苗，接毒 72 h 后收获病毒，滴度为8.14 logTCID₅₀/mL，经灭活后制备疫苗并免疫豚鼠，可获得较高抗体效价。叶阳等^［8］分别在 5 L、50 L 的生物反应器内微载体悬浮培养 Marc145 细胞，确定适宜的微载体浓度为 2.5 g /L 与 3.0 g /L，该条件下能保证细胞和病毒增殖所需营养且符合经济要求，提高抗原效价的优势最为显著。与传统的转瓶式培养方法相比，微载体技术能够通过大幅提升细胞表面黏附膜的覆盖面积，降低细胞所需的培养容器数量，减少资源和空间成本的消耗，获得较高的病毒滴度与抗体效价。

片状载体培养是通过一定材质的填充材料，借助片状载体袋的前后与左右摆动完成培养阶段的传质、传氧，在静态、动态的结合方式下，提升传质、传氧效率，以供细胞贴壁繁殖^［9］。张家友等^［10］在 7.5 L 生物反应器中对片状载体培养参数展开优化，在初始细胞接种密度为每毫升 2×10⁵个，搅拌转速为 120 r/min 的片状载体下，最高细胞密度为( 10. 22 ± 0. 69) × 10⁶个/mL。此方法可获得更高的细胞密度，但存在细胞密度不易放大的缺陷。杨屹等^［11］ 利用 14 L 生物反应器培养Vero 细胞用于人用狂犬病疫苗的生产，向其中的 10 L培养液接种 5.0×10⁹个 Vero 细胞，以灌流培养方式维持培养液中 1.0 g /L 的葡萄糖含量，经 156 h 的培养，所得细胞密度可达 1.0×10⁷个/mL。许冬等^［12］将猪圆环病毒 2 型( PCV2) 接种至 PK-15 细胞悬液中转瓶培养，完成 2 次带毒传代后转接种至片状悬浮，连续收获5 次以上后，有效抗原含量相比于传统工艺可大幅提高 5～10 倍，确定最佳的片状载体细胞接种浓度为每毫升 0.5×10⁶个细胞。片状载体较于微载体的培养工艺，能提高细胞与设备的分离效率，并在实际生产过程中极大降低生产成本。此外，在稳定性方面，片状载体对于外界搅拌系统剪切力的抗干扰性更强，保证细胞培养液间充分交换，获得更高的病毒滴度，利于后续疫苗的纯化操作。

生物反应器的推广能改变动物细胞的培养方式，在增加动物细胞密度的基础上，有效提高病毒滴度，利于扩大病毒产量。PAＲK 等^［13］在 200 L 生物反应器中悬浮培养 BHK-21 细胞，第 3 天即得到每毫升 7.65×10⁶个细胞的活细胞密度。该细胞为口蹄疫病毒疫苗制造的连续细胞系，充分提升了口蹄疫疫苗的生产潜力。

生物反应器的推广推动了口服疫苗的进程，有利于在确定的培养条件下快速、重复性地展开生产，发挥更高的成本效益。LESELLIEＲ 等^［14］为降低英国牛结核病发病率，选择对携带传染源牛分枝杆菌的欧洲獾进行结核病的疫苗接种。在广阔的地理范围内，采用口服方式能充分发挥疫苗的最佳疗效。但口服减毒卡介苗的常规生产多基于液体培养基表面的薄膜生长，利用生物反应器开展培养，所得浓度能远远超过同条件下的薄膜生长，在简化制作工序的同时，更加强了操作的循环性，实现成本节约。

生物反应器内的培养环境较为单一，易于获取稳定性强、免疫原性高的病毒。LIU 等^［15］针对导致手足口病的肠道病毒 A71 的疫苗生产进行探究，在半分批工艺及灌注技术下，可将产量提高 7 ～ 14 倍，获得的候选疫苗同单批获得的候选疫苗相比，具备相似效力及较强稳定性，拓宽了可行的技术工艺。

生物反应器的推广有助于机械化控制，利用培养状态的实时监测，促进整个反应生产过程的透明化。基于生物反应器搭建的控制系统能实现生物反应过程中的参数检测、控制和监控，例如搭建针对实验室厌氧发酵实验中所产气体的在线监测系统，有效解决了厌氧发酵周期长、人工测量劳动强度大的问题，拓展了设备的实时性和灵敏度。

随着生物反应器使用范围的扩大，其结构与组成也在不断变化。作为现代生物工程在大规模食品生产过程中重要的核心应用装置，其设计结构上的科学合理性将直接决定生物反应器的运行效率^{［14－15］}。

3.1.1 潮汐式生物反应器

潮汐式生物反应器是一种能够用于高密度细胞培养操作的台式生物反应器，其中包括 CelCradle^TM生物反应器，在蛋白质制造、病毒和单克隆抗体的高密度细胞培养方面均发挥了突出作用^{［16－17］}。作为世界上唯一能够一次性大规模使用的具有细胞数据自动采集功能的生物反应器，其应用范围也涵盖广泛。通过培养基的左右摆动，使得细胞在各种外界动态环境条件下，能快速高效地吸收来自培养基中的各种养分和氧气^［18］。尹娜等^［16］完成了应用于潮汐式生物反应器的 CelCradle^TM的轮状病毒接种试验，通过在生物反应器培养基中连续注射 3×10⁸个非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞) ，连续培养 7 d，活细胞数量高达 2.75×10⁹个，接种轮状病毒 ZTＲ-68 株 96h，病毒滴度也同时达到了最佳水平。

3.1.2 一次性摇动式生物反应器

一次性摇动式生物反应器是一款小容量的生物反应器，可用于在一次性培养袋中培养哺乳动物细胞和植物细胞。它具有设置方式快速简单、易实现无障碍放大等特点。JULIANA 等^［19］评估了一款耦合切向流过滤和交替切向流过滤的摇动式生物反应器，证明其在灌注运行模式下的最大病毒滴度为 3.28 ～ 3.73 log₁₀ (HA 单位/mL)。该反应器在灌注运行模式下，能充分简化从摇瓶到大型生物反应器的运行过程，有利于帮助人类对重大流行性疾病做出快速反应。

3.1.3 一次性填充床生物反应器

SUN 等^［20］采用一次性填充床生物反应器对 MDCK 进行细胞培养和流感病毒 H1N1 感染，保证接种细胞在 37℃与 5%的 CO₂条件下生长增殖，搅拌速度保持在 45 r/min。借助有效监测数据得知，在该适宜条件下培养 6 d，细胞总数可由 2.0×10⁹个增至 3.2×10¹⁰个。完成 3 d 细胞感染后的最大病毒滴度为 768( HA 单位/μL) 。

微小型生物反应器是一款体积微小，具备良好分析检测及控制功能的反应系统。因其体积微小，能耗较少而被广泛推广应用。在实现高通量生物技术开发过程中，它可以精确保证数据的稳定性，减少整体细胞培养周期，从而加快疫苗产品的研发进程。它的出现更为“精准医学”这一概念的传播奠定了发展基础。李雪良等^［21］详细阐述了当前微小型生物反应器的应用现状。采用微小型生物反应器能够从源头上实现精确测量和环境参数控制，提高研发效率，保证细胞生长的微环境，从而发挥其在生物医药领域的突出优势。

为有效地克服我国现有固定床生物反应器装置结构烦琐，操作工艺复杂，操作过程易产生气泡干扰生产效率等一系列共性问题，研制一款结构简易式的新型固定床生物反应器成为行之有效的技术应对策略。聂简琪等^［22］应用新型固定床生物反应器，在接毒 5 d后，收获病毒总颗粒数为 10. 37 log₁₀ TCID₅₀，等价于2.3×10⁵剂量疫苗的生产量，为细胞源疫苗的大量扩产提供了合理的技术支持。BERRIE 等^［23］利用新型固定床生物反应器有效解决了贴壁细胞培养占地面积大、生产受限条件多、人工成本高的缺陷。该反应器能产生病毒滴度大小为 5×10¹⁰ pfu /cm²，而传统的培养方式仅为 2.67×10⁶ pfu /cm²，为病毒疫苗的生产提供了有效的扩大工艺。聂简琪^［24］基于片状载体、新型支架与TubeSpin 建立了固定床生物反应器缩小模型，此模型相比于微载体培养，能获得更高密度的动物细胞，在低密度接种及无血清培养方面也有一定优势。

应用生物反应器动物细胞培养技术展开工厂化的病毒疫苗生产，在国外已日趋成熟，我国疫苗研发市场发展迅速，尽管与发达国家相比仍存在一定程度的差距，但成效显著，生物医药产业水平稳步提升^［25］。伴随着生物反应器设备的优化，越来越多规模化的动物细胞培养技术开始了更加具备创新涵义与价值取向的变革，为基于细胞培养的病毒疫苗产业化生产提供了新选择，这必将推动我国医用疫苗领域的长足突破。