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六倍体面包小麦（Triticum aestivum L., AABBDD）是三大主粮作物之一，籽粒性状是小麦产量和品质的重要决定因素。然而，小麦籽粒性状很大程度上受到环境条件的影响。同时，小麦的每个小穗包含3朵小花，即使是同一个小穗，不同小花会产生大小不同的籽粒。此外，小麦的重组频率较低，遗传多态性有限，这些因素均增加了解析小麦籽粒性状遗传基础的难度。近日，华中农业大学小麦团队在《Nature Communications》上在线发表了题为“Dynamic atlas of histone modifications and gene regulatory networks in endosperm of bread wheat.”的研究论文，探索了发育调控网络和遗传变异结合解析面包小麦籽粒性状形成的新方法，为小麦籽粒性状的遗传改良提供了重要的基因资源。![]()
为了揭示小麦胚乳发育过程中的基因表达动态变化，研究人员对4 DPA、7 DPA、14 DPA和18 DPA的胚乳进行了RNA-seq。分析小麦中与拟南芥、水稻和玉米和胚和胚乳中特异表达的同源基因的表达模式发现，OsNY-YB132、ZmICE133、AtAAP134和VIM535的同源基因也在小麦胚乳中特异表达；与玉米胚特异表达基因同源的基因在小麦胚中的表达水平普遍较高，尤其是AtS2和Zm3896，并且这些基因在小麦胚乳中几乎检测不到。我们发现三个亚基因组在每个发育阶段表达的基因数量非常接近，有趣的是，41.02%的亚基因组同源基因表现出不对称的表达模式，且大部分（31.98%）在胚乳发育过程中的不对称表达模式持续变化。基因表达时序分析发现，共有53586个基因在胚乳发育过程中表达量显著发生变化（P < 0.05），其中43.17%、12.43%、27.94%和16.45%的基因分别在4 DPA（Cluster 1）、7 DPA（Cluster 2）、14 DPA（Cluster 3）和18 DPA（Cluster 4）特异高表达。众多蔗糖代谢相关基因在14 DPA和18 DPA时特异高表达，如颗粒结合淀粉合成酶I（GBSS，WX-W3和WX-B1）、蔗糖合成酶1（Ss1）、糖基转移酶（SS1）和α-淀粉酶抑制剂（MAI）。这些结果表明，在小麦胚乳发育过程中，存在精确的时空特异性转录调控机制。
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图1 小麦胚乳发育过程中的基因表达动态
组蛋白修饰已被报道与基因的转录高度相关，其可特异性地调控植物发育过程中基因的时空特异表达。通过对4 DPA、7 DPA、14 DPA和18 DPA的胚乳进行H3K27me3、H3K4me3和H3K9ac ChIP-seq，发现活性和抑制性组蛋白修饰共同维持基因的时空转录，且与H3K4me3和H3K9ac相比H3K27me3在早期和后期的修饰水平变化最大。研究人员分析了不同表达模式亚基因组同源基因组蛋白修饰水平的不对称性，结果表明，激活表达的同源基因H3K4me3和H3K9ac修饰水平最高而H3K27me3水平最低；抑制表达的同源基因H3K27me3修饰水平最高而H3K4me3和H3K9ac修饰水平偏低；对称表达的亚基因组同源基因其3种组蛋白修饰水平在3个亚基因组中相当。此外，A和D亚基因组的组蛋白修饰在维持不对称表达模式中强烈拮抗，在胚乳发育早期（4和7 DPA）尤其明显。![]()
图2 小麦胚乳发育过程中的动态组蛋白修饰图谱
淀粉生物合成包括两个连续的过程。首先，光合作用产物和蔗糖被水解成葡萄糖1磷酸（G1P），然后G1P通过一系列酶的作用产生直链淀粉和支链淀粉。在胚乳发育早期（4 DPA和7 DPA），大多数参与生成G1P的基因表达，而利用G1P合成直链淀粉和支链淀粉的基因则在发育后期（14 DPA和18 DPA）特异表达。值得注意的是，H3K27me3、H3K4me3和H3K9ac修饰水平的动态变化与胚乳发育过程中淀粉合成相关基因表达的变化密切相关。例如，BT1在早期几乎不表达，但在后期开始表达。与此同时，与早期阶段相比，BT1上的H3K27me3修饰水平在后期降低，而H3K4me3和H3K9ac修饰水平升高。Waxy、SBE和DBE的表达在后期升高，这些基因在14 DPA和18 DPA时几乎不被H3K27me3标记，但H3K4me3和H3K9ac修饰在这些基因上高度富集。麦谷蛋白和麦醇溶蛋白是面包小麦中两种主要的种子贮藏蛋白质（SSPs），已有86个基因被报道参与麦谷蛋白和麦醇溶蛋白的合成。我们发现，共有77.91%的基因至少在一个时期中表达（TPM > 0.5），所有这些基因在14 DPA和18 DPA时特异高表达。大多数与SSPs相关的基因在14 DPA和18 DPA时H3K4me3和H3K9ac高度富集，但H3K27me3水平降低。我们进一步研究了胚乳发育过程中与淀粉合成相关和编码SSP的基因在不同亚基因组中表达的不对称性，并分析了每个亚基因组同源基因的组蛋白修饰。结果表明，亚基因组同源基因的偏好表达与H3K4me3和H3K9ac的富集程度相关。![]()
图3 淀粉合成相关和贮藏蛋白编码基因在胚乳发育过程中的基因表达和组蛋白修饰动态变化
转录因子（TF）作为上游调控因子，控制下游靶基因活性，介导器官分化（Kaufmann et al., 2010）。我们对4 DPA、7 DPA、14 DPA和18 DPA的胚乳进行了ATAC-seq，根据基因共表达模式和染色质开放区域中识别的TF印迹，我们构建了一个影响小麦胚乳发育的TF调控网络。共有89个TFs参与了小麦胚乳发育的调控。Hub基因中包含前人报道可以激活高分子量麦谷蛋白亚基基因Glu-1Bx73表达的TaFUSCA3/TaABI3（TraesCS2A02G554300）。其他已被报道参与小麦胚乳发育过程中淀粉和贮藏蛋白质积累的TF也出现在构建的调控网络中，包括TaNAC019（TraesCS3A02G077900、TraesCS3B02G092800和TraesCS3D02G078500）（Gao et al., 2021）、PBF（TraesCS5B02G154100）（Zhu et al., 2018）、TabZIP28（TraesCS2B02G167900）（Song et al., 2020）、GA依赖的MYB TF TaGAMyb（TraesCS6D02G173000、TraesCS5A02G159600、TraesCS5B02G157300、TraesCS1D02G283100、TraesCS4D02G176500和TraesCS1A02G219400）。![]()
图4 小麦胚乳发育过程中的基因表达调控网络
随后，我们分析了直接调控与淀粉合成和/或SSPs相关基因表达的TF。我们鉴定了一个乙烯响应因子ERF5（AP2/ERF转录因子家族，TraesCS6D02G225700）（Yoo et al., 2008; Pan et al., 2012），该基因在后期调控的靶基因数目最多。ERF5不仅调控SSPs编码基因（α-麦胶蛋白和ω-麦胶蛋白）的表达，还调控与淀粉合成相关的基因（FBA和DBE）。更重要的是，ERF5还可作为多个hub TFs的上游调控因子，包括WRKY55和HSFA6B，它们都是调控SSP编码基因的关键TFs。ERF5的表达与H3K9ac和H3K4me3的修饰水平高度相关。单倍型分析结果表明，不同ERF5单倍型的粒长、粒宽和千粒重差异显著。与ERF5在胚乳发育时期基因表达调控网络中的关键作用一致，当ERF5过表达时，籽粒更显变窄，而基因编辑突变体产生的籽粒与野生型相似，这可能是由于基因冗余所致。
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图5 ERF5是淀粉和贮藏蛋白积累的关键调控因子
为了进一步评估在基因调控网络中鉴定的TFs及其靶基因对籽粒性状的遗传效应，我们利用包含516份具有广泛遗传多样性的自然群体的序列变异与这些材料在不同年份、地点收集的籽粒性状进行了全基因组关联分析（GWAS）。我们在调控网络中鉴定了969个位于QTL区域的靶基因。网络中鉴定的89个hub TFs每个至少调控这些靶基因中的一个，其中MYB118（TraesCS3B02G400200）和GATA12（TraesCS3B02G308500）位于QTL区域。随后，我们分析了89个hub TFs和1,649个靶基因的变异对籽粒性状的贡献，这些靶基因包括位于QTL区域的969个基因以及MYB118和GATA12的预测靶标。71个hub TFs的遗传多态性显著影响小麦的GW、GL、GL/GW或/和TGW。围绕这些基因及其1622个靶基因，我们构建了一个基因表达子网络。在这些hub TFs中，包含已被报道在种子成熟过程中起重要作用的MYB118（TraesCS3B02G400200）。在拟南芥中过表达其同源基因会导致SSPs和其他种子成熟相关蛋白的显著积累。此外，myb118突变体的种子表现出成熟相关基因在胚乳中特异性抑制。我们发现，MYB118是胚乳发育后期（14 DPA）的关键调控因子，两个不同等位基因型的GL、GW和TGW显著差异。此外，不同基因型的NAC029（TraesCS4B02G173600）的籽粒在GW、GL和TGW上差异显著。有趣的是，负向调控参与花色苷生物合成的MYB4（TraesCS7A02G272100），其不同基因型的GW、GL、GL/GW以及TGW均表现出显著差异。这些结果表明，通过构建基因调控网络结合遗传变异分析，可以快速鉴定影响籽粒性状在内的复杂性状的关键基因。![]()
图6 网络中关键调控因子的自然变异影响小麦籽粒性状
华中农业大学小麦团队副研究员贺超、已毕业硕士生毕思腾、博士研究生李雨琦为该论文的共同第一作者，华中农业大学小麦团队教授鄢文豪和茆海亮为该论文的共同通讯作者。感谢洪堡大学教授Kerstin Kaufmann，华中农业大学教授兰彩霞、苏汉东、陈伟、李强的指导和帮助，感谢已毕业博士生宋成祥、硕士生张和平、已毕业博士生许欣桐、硕士生Sulaiman Saeed做出的贡献。该研究得到了生物育种-国家科技重大专项（2023ZD0406802）和湖北省科技重大项目的支持（NO.2022ABA001）。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-53300-7
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