兰州大学段廷玉教授团队：PGPR和木霉使箭筈豌豆生理和叶际细菌向着拮抗由菠菜刺盘孢引起的炭疽病的方向转变

文摘 2024-07-18 08:02 甘肃

文章信息

期刊名称：Grassland Research 草地研究（英文）

英文标题：Plant growth-promoting rhizobacteria and Trichoderma shift common vetch (Vicia sativa) physiology and phyllosphere bacteria toward antagonism against anthracnose caused by Colletotrichum spinaciae

中文标题：PGPR和木霉使箭筈豌豆生理和叶际细菌向着拮抗由菠菜刺盘孢引起的炭疽病的方向转变

第一作者：朱瑞（兰州大学）

通讯作者：段廷玉（兰州大学）

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编译者：朱瑞兰州大学草地农业科技学院在读硕士生

说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘要

研究背景——植物叶际微生物对寄主植物保护具有重要意义。促进植物生长的根际细菌（PGPR）和木霉是用于病害防治的常见生物防治剂（BCAs）。病原体和生物防治剂可以改变根际微生物组成，然而PGPR或木霉对植物叶际微生物，特别是对于涉及病原体和BAC之间相互作用的影响，尚不清楚。

研究方法——采用高通量测序鉴定箭筈豌豆与菠菜刺盘孢、两种PGPR包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）相互作用的叶际细菌群落。我们评估了单独和联合接种PGPR、木霉和菠菜刺盘孢处理的箭筈豌豆炭疽病的严重程度、叶际细菌多样性和组成以及植物防御酶活性与激素分子之间的关系。

研究结果——单独接种PGPR或木霉可降低病害严重程度。木霉降低了水杨酸含量，PGPR提高了植物的过氧化氢酶活性，共同接种PGPR和木霉降低了SA含量。单独或联合接种PGPR和木霉可改变与病害相关的叶际细菌，这与植物防御酶和激素分子有关。

研究结论——我们认为PGPR和木霉诱导的植物防御反应导致一部分有利的叶绿体细菌的富集，从而促进植物对病害的防御。

关键词

炭疽病，生物防治，PGPR，木霉，叶际细菌，生理

前言

叶际微生物是栖息在植物地上组织的微生物，主要包括细菌和真菌，被认为是具有拮抗特性的有益共生体（Xu et al., 2022）。叶际微生物从为其提供有利生长条件的寄主植物中获取养分，并刺激有助于植物健康和生产力的生理过程（Singh et al., 2016）。当植物地上组织受到病原体的攻击时，拮抗叶际微生物会改变参与植物防御的代谢途径（Singh et al., 2016）。病原体入侵是影响植物叶际微生物多样性和组成的关键因素（Li et al., 2022）。例如，褐斑病病原的入侵改变了大豆叶际微生物群落的多样性（Díaz-Cruz & Cassone, 2022）。

植物病原体通常会在植物宿主中诱导复杂的生理反应。例如，病原体的入侵改变了植物的过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）和多酚氧化酶（PPO）活性和过氧化氢（H2O2），一氧化氮（NO），茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量（(Wawrzynska et al., 2008）。研究表明，黑根霉（Rhizopus nigricans）侵染的西红柿（Solanum lycopersicum）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染的拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Shi et al., 2009）中产生了大量的NO。SA和JA是植物激素和信号物质，在有益微生物诱导的信号转导中起关键作用（Delaney, 1997），它们可以诱导植物组织产生与病害过程相关的蛋白质，从而调节植物微生物区系，并招募更多有益微生物来应对病原体侵袭带来的压力，从而有利于植物健康（Lebeis et al., 2015）。

炭疽病是箭筈豌豆（Vicia sativa）一种常见的严重病害，箭筈豌豆是一种广泛种植的豆科牧草，蛋白质含量较高（Wang et al., 2019），由于其直接用作牲畜饲料，因此不建议将化学品用于病害管理。生防微生物是管理真菌病害的良好候选者（Larkin & Fravel，1998），包括作物炭疽病（Chandanie et al., 2006）。促进植物生长的根际细菌（PGPR）如芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas），以及促进植物生长的真菌（PGPF），如木霉（Trichoderma），是广泛用于对抗不同植物病原体常见的生物防治剂（BCAs）（Haas & Keel, 2003; Chen et al., 2007; Avis et al., 2008）。通过BCAs防控植物炭疽病的例子包括：紫花苜蓿（Medicago sativa）（Li et al., 2023）、长辣椒（Capsicum annuum var. acuminatum）（Jetiyanon&Kloepper，2002）、鳄梨（Persea americana）（Guevara-Avendano et al., 2019）和芒果（Mangifera indica）（Vivekananthan et al., 2004; Mathews et al., 2011）的炭疽病以及由禾生炭疽菌（Colletotrichum graminicola）引起的高粱（Sorghum bicolor）炭疽病（Manzar et al., 2021）。

BCAs通过与病原体竞争或产生抗菌化合物直接拮抗病原体以控制植物病害（Spadaro & Droby, 2016）。与化学防治方法相比，PGPR能诱导植物产生系统抗性，因此能对入侵的病原体产生长期影响（Lugtenberg & Kamilova，2009）。PGPR可以产生活性化合物，促进其对病原体的抑制作用（Olenska et al., 2020）。此外，PGPR与植物的相互作用可改善植物的生长和养分吸收，从而提高产量（Kloepper et al., 1980）。然而，PGPR和木霉联合接种对植物通过叶际微生物对病原体胁迫的响应尚不清楚。

土壤是植物叶际微生物定殖的常见来源（Vorholt，2012; Zarraonaindia et al., 2015; Grady et al., 2019），微生物如链霉菌属（Streptomyces）可以通过维管束向地上组织进行内生异位（Kim et al., 2019）。芽孢杆菌属（Bacillus）和木霉属（Trichoderma）影响了土壤中的细菌群落结构（Mawarda et al., 2020）。例如，当枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis XF-1）接种到白菜（Brassica rapa）根际后，土壤细菌和真菌群落起初大量减少，但随着植物生长逐渐恢复（Liu et al., 2018a）。含有芽孢杆菌属或木霉属的生物肥料重塑了扁叶香果兰（Vanilla planifolia）的土壤微生物群落（Xiong et al., 2017）。BCAs引起的土壤微生物变化可能也会间接影响叶际细菌的群落结构，然而这很少被研究。

箭筈豌豆是一种重要的一年生豆科牧草，也是世界范围内种植的绿肥作物（Min et al., 2020）。箭筈豌豆营养丰富，适口性好（Darre et al., 1998），其强大的固氮能力在提高土壤肥力方面起着重要作用（Mikic et al., 2014）。然而，箭筈豌豆的产量和品质受到多种病害的限制。截至2022年底，全球共报告了52种影响箭筈豌豆的病害，其中炭疽病在美国和中国造成的损害最为严重（Wang et al.，2019）。Wang等人在2019 年首次报道了甘肃省夏河县由菠菜刺盘孢（Colletotrichum spinaciae）引起的箭筈豌豆炭疽病。该病对箭筈豌豆造成严重危害和极大的产量损失。然而目前仍然没有有效的控制方法，特别是环境友好的方法，例如使用BCAs来控制箭筈豌豆炭疽病。

本研究旨在阐明BCAs处理对植物生长、生理生化指标、病害严重程度、防御特征和叶际细菌的影响是否与病害严重程度有关。我们的研究包括四种生物的相关组合，即宿主植物、病原体、PGPR（两种芽孢杆菌菌株）和PGPF（木霉）两种有益生物防治剂。假设：（1）PGPR和木霉将增强植物对病原体的防御，使组合更有效;（2）PGPR和木霉将改变叶际细菌群落的多样性和组成以利于植物健康。

材料与方法

植物、PGPR、木霉和病原体

箭筈豌豆（V. sativa cv. Lanjian No. 3）是青藏高原种植的主要牧草品种。箭筈豌豆种子和自箭筈豌豆种植田中分离出的长枝木霉（菌株LZU-G01）由兰州大学草地农业科技学院提供。PGPR菌株为从青藏高原高寒草地土壤中分离出的枯草芽孢杆菌（菌株GAU-00108）和地衣芽孢杆菌（菌株GAU-0687），由甘肃农业大学草业科学学院提供。从甘肃夏河采集发生炭疽病的箭筈豌豆病叶，剪取病健交界处在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上分离和纯化菠菜刺盘孢（Wang et al., 2019）。长枝木霉（T. longibrachiatum）和炭疽菌（C. spinaciae）在25°C的培养箱中培养21天后用无菌水制备每毫升含有10⁶个分生孢子的接种剂。

试验设计

在温室建立盆栽试验，设置8种处理，每个处理4盆（共32盆），每盆15株箭筈豌豆。试验在兰州大学榆中校区草地农业科技学院进行。8个处理包括有混合菌株和无混合菌株植物的23组合，其中：(1) 种植时接种以相同比例混合的两种芽孢杆菌（P+）或不含 PGPR（P-），(2) 1周后接种含长枝木霉（T+）或不含长枝木霉（T-）的悬浮液；(3) 4周后接种含菠菜刺盘孢（C+）或不含菠菜刺盘孢（C-）的悬浮液（表1）。制备的植物生长基质含75% 的沙子和 25% 的土壤（体积比），所用土壤来自兰州市榆中县。沙子和土壤过2 mm筛后，沙子于170℃下干热灭菌5小时，土壤于140℃下干热灭菌2小时。

箭筈豌豆种子用75%乙醇消毒10 min后用无菌蒸馏水洗涤3次，在潮湿的滤纸上于25°C的黑暗条件下培养48 h发芽。移植前，将3g PGPR粉状菌剂（含有50% 枯草芽孢杆菌和50% 地衣芽孢杆菌）加入16个P+处理的盆中，P-处理的16个盆接种3g灭菌的PGPR粉状菌剂。每个花盆共移植18颗发芽种子。花盆尺寸为15 cm（底部直径）× 18 cm（高度）×22 cm（顶部直径），并装3 kg土壤基质。移植一周后，将18株植物间苗到15株以确保它们大小均匀。用每毫升含有6×106个分生孢子的悬浮液（21 mL/盆）浇灌8盆接种PGPR的箭筈豌豆和8盆未接种PGPR的箭筈豌豆，以产生P-T+和P+T+处理。每盆用21 mL无菌水浇灌其余16个花盆，以产生P-T-和P+T-处理。

生长4周后，4个处理每盆喷洒每毫升含有1×106个分生孢子的悬浮液（30 mL），以产生P-T-C+、P-T+C+、P+T-C+和P+T+C+处理。其余16个盆每盆喷洒30mL无菌水，以产生P-T-C-、P-T+C-、P+T-C-和P+T+C-处理。用黑色塑料袋覆盖植物48 h以保持水分，每天观察发病情况。每盆随机选取100片箭筈豌豆叶片，评价病原菌接种7 d后炭疽病发生的严重程度，保留炭疽病叶片（0.1 g）用于分离病原菌。在收获前使用病情指数（DI）分析病害严重程度。通过目测病斑覆盖叶片的百分比，以0-5级记录叶斑的严重程度，如下所示：0，无症状；1：叶面积0.1-5% 的覆盖率；2：>5-20% 的覆盖率；3：>20-50% 的覆盖率；4：>50-75% 的覆盖率；5：>75% 的覆盖率。

DI=100

其中病害严重程度等级：i = 0、1、2、3、4、5；Ln 是每种病害严重程度的叶片数，Ln是叶片总数（Li et al., 2023）。

植物收获和测定

植物在接种炭疽菌病原体3 w后收获。将箭筈豌豆的茎叶和根分开收获，记录每盆箭筈豌豆的茎叶鲜重、茎粗、根长、根鲜重和根干重。从每株箭筈豌豆的下部、中部和上部随机选取叶片，将新鲜茎叶分成三个子样本。取样后，将样品装入有冰袋的取样盒中运回实验室，在-80℃下保存。取0.4 g的子样本用ELISA试剂盒（上海酶联生物技术有限公司，中国上海）测定H2O2、NO、SA和JA含量。第二个1.2 g子样品使用各自的检测试剂盒（苏州格锐斯生物科技有限公司）测定 POD、PPO、CAT和SOD活性。使用相同的样本测定丙二醛（MDA）（Gao et al., 2018），叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素的含量（Shu et al., 2010）。第三个子样本（约1.0 g），首先用自来水冲洗叶片以去除表面沉淀物，并用80%乙醇消毒2 min，然后用1% NaClO溶液消毒5 min，再用80%乙醇消毒1 min。最后，将叶片在无菌水中洗涤3次，在液氮中快速冷冻，并在-80°C下保存用于测叶际细菌。剩余的茎叶样本用于测定茎叶鲜重和干重。

表1 八种治疗的治疗代码和实验操作的时间安排。

DNA提取、PCR扩增和Illumina MiSeq测序

使用植物DNA提取迷你试剂盒B (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA)按照标准化方案从30~200 mg植物粉末中提取微生物群落的基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶上评估DNA质量，并使用NanoDrop One超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）测定DNA浓度和纯度。为了分析叶际细菌群落，我们在BioRad S1000 PCR热循环仪(Bio-Rad Laboratory, CA, USA)上用引物338F (50-ACTCCGGGAGGCAGCAG-30) 和806R (50-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-30) 扩增了16S rRNA基因的V3-V4高变区（Caporaso et al., 2012），引物由Invitrogen公司合成。根据GeneTools分析软件（版本4.03.05.0, SynGene）以等密度比例混合 PCR产物，并使用E.Z.N.A.凝胶提取试剂盒（Omega，USA）纯化。使用用于Illumina®的NEBNext® Ultra™ II DNA文库制备试剂盒（New England Biolabs，MA，USA）生成测序文库，在Qubit@ 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）上进行评估后，在Illumina Nova6000平台上进行测序，叶际细菌中16SrRNA基因的高通量测序在广东美格基因生物科技有限公司完成（中国广东）。

统计分析

相关指标以四个生物学重复的平均值±标准误（SEM）表示。使用统计分析软件SPSS 26.0 （IBM，Inc.，Armonk，NY，USA）对数据进行方差分析（ANOVA）。均值之间的比较由Turkey’s HSD确定。P≤0.05具有统计学意义。处理均值跨度较大的情况下，在方差分析之前对数据进行对数转换，以避免数值过大不当影响处理之间的统计比较（Li et al., 2023）。使用R统计程序（版本4.3.1）对叶际细菌的数据进行分析和可视化。在门和属分类水平上计算叶际细菌的相对丰度，并使用R软件中的tidyverse和ggplot2包进行可视化。使用Richness，Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数计算α多样性以评估叶际细菌多样性。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）使用R中的vegan包（Dixon，2003）进行，并用ggplot2包进行可视化。LEfSe分析在Galaxy网站上进行（http:// huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/，v1.0）（Segata et al., 2011）。使用R软件中的ggpp，ggplot2和ggpmisc包对植物酶，激素信号，MDA和叶绿素含量以及叶际细菌α多样性进行线性回归分析（Jing et al., 2015）。酶、激素、MDA、叶绿素和叶际细菌多样性用于使用R软件的piecewiseSEM和readxl包构建结构方程模型（SEM）（Cui et al., 2020）。利用R软件的pheatmap, psych包生成植物生理指标与属水平叶际细菌相对丰度的斯皮尔曼相关性热图（Chen et al., 2019）。

结果

植物生长和病害严重度

PGPR和木霉单独或共同接种抑制了植物的生长，特别是在病原体胁迫下，抑制效果更为明显。BCAs处理的植株的分枝数、根长、茎叶生物量、根生物量和总生物量均低于对照组（图1a，表S1）。侵染炭疽病的植物在侵染后2 w表现出由病原体引起的典型症状，而未侵染的植物则没有症状。接种PGPR和木霉可使箭筈豌豆的发病率分别降低26.4%和20.8%，病情指数降低33.4%和27.4%（图1b，c）。PGPR和木霉（P+T+C+）的联合接种与对照组（P-T-C+）表现出相似的发病率和病情指数（图1b，c）。

植物防御酶活性

侵染炭疽病使植物POD和PPO活性提高31.34% 和 32.43%（图2a、b，表S1）。与未接种PGPR（P-）的箭筈豌豆相比，接种PGPR（P+）的箭筈豌豆PPO、CAT和SOD活性分别提高了18.80%、20.37%和41.20%（图2b-d）。PGPR接种和病原侵染（P+C+）的植物PPO活性水平最高（图2b）。接种木霉对箭筈豌豆中这些酶的活性没有显著影响（表S1）。

图1 接种PGPR（Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis, P+）和未接种PGPR（P-），接种木霉（T. longibrachiatum，T+）和未接种木霉（T-）处理下箭筈豌豆的总生物量（a）、发病率（b）和病情指数（c）；所有值均为四个生物学重复的平均值 ± SEM。柱状图上方的不同小写字母表示表示在P <0.05水平上相比之下存在显著差异。SEM为标准误。

图2 接种PGPR（Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis, P+）、木霉（T. longibrachiatum，T+）和侵染病原（Colletotrichum spinaciae，C+）以及未接种PGPR（P-）、木霉（T-）和未侵染病原（C-）处理下箭筈豌豆的POD（a）、PPO（b）、CAT（c）和SOD活性（d）。所有值均为四个生物学重复的平均值 ± SEM。柱子上方不同的小写字母表示在P<0.05水平上相比存在显著差异。星号表示T-C-和T-C+或T+C-和T+C+之间存在显著差异（a），由 Tukey’s HSD检验确定。*表示在同一处理中，T-C-和T-C+，T+C-和T+C+在0.05（0.01≤P<0.05）水平上存在统计学差异，** 表示在0.01（0.001≤P<0.01）水平上存在统计学差异。SEM为标准误。

H₂O₂、NO、SA、JA、MDA 和叶绿素含量

H₂O₂、NO、SA和JA含量的三因素方差分析揭示了PGPR、长枝木霉和病原体之间的相互作用（表S1）。与对照组（P-T-C-）相比，接种PGPR（P+T-C-）或长枝木霉（P-T+C-）的健康植株和联合接种PGPR和长枝木霉（P+T+C+）的发病植株的H2O2含量显著升高。然而，与PGPR和长枝木霉（P+T+C-）共同接种的健康植株的H2O2含量最低（图3a）。

除PGPR和长枝木霉共同接种处理的健康植株（P+T+C-）外，其余处理NO的含量均有显著变化（图3b）。与P-T-相比，接种木霉（P-T+）和PGPR和长枝木霉（P+T+）共同接种可显著降低植株SA含量7.39%和7.02%（图3c）。与对照组相比，接种PGPR（P+T-C-）的健康植株的JA含量显著升高，但其余处理的JA含量较低（Fig. 3d）。

接种PGPR、长枝木霉或病原体后，箭筈豌豆的MDA含量分别比P-、T-和C-显著增加56.88%、23.26%和37.43%（图3e）。与C-相比，长枝木霉显著降低了叶绿素a含量，而病原菌（C+）显著提高了叶绿素a含量11.01%（图3f，表S1）。与P-T-相比，P+T-的总叶绿素含量显著提高了16.91%（图3f）。

图3 接种PGPR（Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis, P+）、木霉（T. longibrachiatum，T+）和侵染病原（Colletotrichum spinaciae，C+）以及未接种PGPR（P-）、木霉（T-）和未侵染病原（C-）处理下箭筈豌豆的H₂O₂（a）、NO（b）、SA（c）、JA（d）、MDA（e）、总叶绿素（f）和chla/b（g）的含量。所有值均为四个生物学重复的平均值 ± SEM。柱子上方不同的小写字母表示处理间在P <0.05水平上存在显著差异（a，b，d）。两个柱子上方不同的小写字母表示处理组间在P <0.05水平上存在显著差异（c，f）。柱子上方的不同大写字母表示在P <0.05下比较存在显著差异（e）。星号表示T-C-和T-C+或T+C-和T+C+之间存在显著差异（c,e），由 Tukey’s HSD检验确定。*表示在同一处理中，T-C-和T-C+或T+C-和T+C+在0.05水平上存在统计学差异（0.01≤P<0.05），***表示在0.001水平上存在极显著的统计学差异（P<0.001）。SEM为标准误。

叶际细菌群落结构及多样性

共获得3,895,625个过滤干净标签（121738.28个标签/样本）和372个细菌操作分类单元（OTU，序列以97%相似度聚类）。8个处理共有45个OUT，特有OTU如下：P-T-C+（35）、P+T+C+（22）、P+T-C+（20）、P-T+C-（18）、P-T-C-（14）、P+T-C-（12）、P-T+C+（9）和P+T+C-（7）（图4a）。叶际细菌的群落结构在健康和发病植物之间有所不同。PCoA结果表明，病原菌处理存在很强的聚类性（图4b）。基于Bray-Curtis距离的置换多元方差分析（PERMANOVA）结果也表明，病原菌是细菌群落组成的重要驱动因素（P=0.001）（图4b，表S2）。接种PGPR（P+T-C-/+）或木霉（P-T+C-/+）不会改变健康（P-T-C-）或发病植物（P-T-C+）中叶际细菌群落的组成和结构（图4b，表S2）。α多样性指数（Richness、Chao1、ACE和Shannon指数）均受病原菌影响（图4c-f）。分析表，Richness（P=0.0014）、Chao1（P=0.0007）和ACE指数（P<0.0001）均显著高于健康植物（表S1）。发病植物的Shannon指数（P=0.0240）显著低于健康植物（图4f，表S1）。8个处理的Simpson指数无显著差异（图S2，表S1）。PGPR和木霉对叶际细菌群落的α多样性影响不大（表S1）。

图4 PGPR、木霉和病原对箭筈豌豆叶际细菌多样性的影响。（a）不同处理箭筈豌豆的操作分类单元（OTU）个数，（b）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA），（c）丰富度，（d）Chao1，（e）ACE和（f）Shannon指数。P+ 为接种PGPR（Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis）的箭筈豌豆，P- 为不接种PGPR；T+ 为接种木霉（T. longibrachiatum）的箭筈豌豆，T- 为不接种木霉；C+ 为被病原菌（Colletotrichum spinaciae）侵染，C- 为未被病原菌侵染。

各处理的群落组成和LEfSe分析

根据物种聚类对OTU的代表性序列进行注释后，所有细菌OTU被分为14个门、26个纲、62个目、98个科和154个属。不能归入任何已知组的序列被标记为‘Unassigned’，平均相对丰度低于0.1%的组被归类为‘Others’。变形菌门（Proteobacteria）是最主要的门，占所有处理中观察到的细菌相对丰度的26%以上。其余细菌分布在厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和其它（图5a）。

在属水平上，芽孢杆菌属（Bacillus）的相对丰度在健康植物（C-）中最高，金黄杆菌属（Chryseobacterium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）的相对丰度在病原侵染处理中（C+）最高（图5b，表S1）。PGPR、木霉和病原也改变了叶际细菌在纲、目和科水平上的相对丰度（图S2）。通过LEfSe分析鉴定出组间丰度差异显著的特征属，探究叶际细菌对PGPR和木霉的特异性响应。我们观察到与对照组（P-T-C-）相比，通过接种木霉（P-T+C-）和联合接种（P+T+C-）富集的属分别是副球菌属（Paracoccus）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）（图5c-e）。与病对照（P-T-C+）相比，PGPR接种富集的属主要是Kaistia，双接种处理富集的属是金黄杆菌属（Chryseobacterium）、Kaistia和黄杆菌属（Flavobacterium）（图5f-h）。

图5 不同处理下细菌门和属的平均相对丰度（%）及细菌属的LEfSe分析。门水平（a）和属水平（b）的相对丰度。对照健康植物的特征细菌属与仅接种PGPR（c）、仅接种木霉（d）和共同接种（e）的处理；对照发病植物的特征细菌属与仅接种PGPR（f）、仅接种木霉（g）和共接种（h）的处理相比。所有细菌属用LDA评分>2展示。P+ 为接种PGPR（Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis）的箭筈豌豆，P- 为不接种PGPR；T+ 为接种木霉（T. longibrachiatum）的箭筈豌豆，T- 为不接种木霉；C+ 为被病原菌（Colletotrichum spinaciae）侵染，C- 为未被病原菌侵染。

植物防御物质与叶际细菌群落多样性和组成的相关性

植物防御酶的活性和激素信号物质显著影响了寄主植物的叶际细菌群落。PPO活性与Richness呈正相关，与Simpson指数呈负相关，而NO和JA含量与Richness呈负相关（图6a-c）。JA和叶绿素a含量与Simpson指数呈正相关，MDA含量与Simpson指数呈负相关（图6d-g）。POD、CAT和SOD活性以及H2O2、SA、叶绿素b和总叶绿素含量与Richness和Simpson指数无关（图S3、S4）。如相关性热图所示（图7），金黄杆菌属（Chryseobacterium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）、黄杆菌属（Flavobacterium）和假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度与POD和PPO活性呈显著正相关，与JA和NO含量呈显著负相关。芽孢杆菌属（Bacillus）和Paenibacillu属的相对丰度与POD和PPO活性呈显著负相关，与JA含量呈显著正相关。SEM分析表明，PGPR与酶（PPO，CAT）活性增加显著相关，病原侵染与酶活性（PPO，CAT）和激素（SA，JA）含量的变化显著相关，这些变化与叶际细菌多样性显著相关（图8）。

图6 （a）PPO活性、（b）NO、（c）JA 和箭筈豌豆叶际细菌的Richness之间以及（d）PPO活性，（e）MDA，（f）JA，（g）叶绿素a和箭筈豌豆叶际细菌的Shannon指数之间的回归方程。图中显示了相关系数（R²）和统计学显著性。P+ 为接种PGPR（Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis）的箭筈豌豆，P- 为不接种PGPR；T+ 为接种木霉（T. longibrachiatum）的箭筈豌豆，T- 为不接种木霉；C+ 为被病原菌（Colletotrichum spinaciae）侵染，C- 为未被病原菌侵染。

图7 POD、PPO、CAT和SOD活性和H₂O₂、NO、SA、JA和MDA含量与叶际细菌属水平相对丰度之间基于Spearman的相关矩阵热图。红色表示正相关，蓝色表示负关系，颜色越深表示相关性越高。* 表示小网格对应的两个变量在0.05水平上的有统计学差异（0.01≤P<0.05）；** 表示在0.01水平上具有统计学差异（0.001≤P<0.01）。

图8 PGPR、木霉和病原对叶际细菌多样性影响的结构方程模型。实心箭头表示显著的效应大小（* 0.01≤P<0.05， ** 0.001≤P<0.01， *** P<0.001，虚线：P >0.05），其中绿色表示正相关，橙色表示负相关。标准化路径系数标注在路径旁边。PPO：多酚氧化酶；H₂O₂：过氧化氢；SA：水杨酸；Richness：叶际细菌的α丰富度；Chl a：叶绿素a，Total Chl：总叶绿素；PCoA1：PCoA第一个轴，PCoA2：PCoA第二个轴。

讨论

自然条件下，PGPR（Bacillus）、PGPF（Trichoderma）等微生物和病原经常定殖或侵染相同的寄主植物。因此，植物、生防微生物和病原之间的复杂相互作用对于了解它们在自然生态系统中的共存非常重要。我们通过盆栽实验，评估了箭筈豌豆植物与三类微生物的相互作用。这些微生物包括两种PGPR（B. subtilis and B. licheniformis）、木霉（T. longibrachiatum）和致病性炭疽病真菌（C. spinaciae）的组合。木霉和PGPR是控制植物真菌病原体病害的常见BCAs。研究表明，单独接种PGPR或木霉可显著降低病害严重程度，并且在抑制由菠菜刺盘孢引起的箭筈豌豆炭疽病方面比两者联合接种更有效。此外，箭筈豌豆叶际细菌群落的结构和多样性主要受炭疽菌的影响。单独或联合接种PGPR和木霉，一些叶际细菌属的丰度被显著富集。植物防御酶活性和激素信号物质的变化与寄主植物叶际细菌密切相关（图9）。

图9 接种促进植物生长的根际细菌（PGPR）和木霉对叶际细菌群落产生不同影响的潜在机制。PGPR和木霉可改变化学物质水平(例如PPO、JA等)，触发植物防御信号通路，并导致叶际细菌群落发生变化，从而有可能增加或降低侵染率。

PGPR和木霉病可降低病害严重度，但抑制了植物生长

Bacillus和Trichoderma已被广泛用作植物病害的BCAs，并被商业开发为生物肥料和生物农药以提高农作物生产力（Arif et al., 2020; Penha et al., 2020）。研究表明Trichoderma和B. velezensis是高效的（Izquierdo-García et al., 2020），且共同接种在病害控制方面更有效（Liu et al., 2018b）。在本研究中，单独接种PGPR或T. longibrachiatum可抑制由C. spinaciae引起的箭筈豌豆炭疽病。这与Gutierrez-Moreno等人的研究结果一致，其研究结果表明菜豆（Phaseolus vulgaris）品种：Negro San Luis（NSL）是一种高度易感的地方品种，Trichoderma虽可以使病害减少，但产量并未提高（Gutiérrez-Moreno et al., 2021）。

我们发现PGPR和木霉联合使用对病害严重程度没有显著影响，但抑制了植物生长。微生物在争夺资源和生产抗菌素时的相互影响所产生的调节作用可能会协同增强对病原生长的抑制（Niu et al., 2020）。用于开发生物防治菌群的微生物通常是根据其自身抑制病害的能力来选择的（Sarma et al., 2015）。与单个菌株相比，这种方法通常导致多菌株混合物的功效相同甚至更低（Sarma et al., 2015）。此外，细菌和真菌通常有共同的基质（相同的寄主植物），它们在许多环境中的空间接近性导致了协同或拮抗相互作用（Mille-Lindblom et al., 2006）。细菌和真菌之间的相互拮抗作用可能是由于涉及化感化学物质产生的干扰竞争，这可能发生在定殖的初始阶段（Freeman et al., 2004）。根际定殖不足会削弱生防微生物菌株的有益作用，导致病害防治能力下降或失败（Mille-Lindblom et al., 2006; Niu et al., 2020）。

我们的第一个假设是PGPR和木霉之间可能存在协同作用，并且当两者都存在于同一寄主植物中时它们在促进抗病性方面更有效，但并未被支持。大多数有益微生物在抑制植物病害方面具有协同作用（Sarma et al., 2015; Vorholt et al., 2017）。BCAs的经验混合物真菌木霉属（Trichoderma spp.）和生防细菌芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的组合表明这两种微生物高度相容（Izquierdo-Garcia et al., 2020; Niu et al., 2020）。然而，在我们的研究中这两者在帮助植物防御箭筈豌豆炭疽病方面没有表现出协同作用。因此，有必要进一步筛选合适的菌株×品种组合，以获得对箭筈豌豆炭疽病有效的BCAs。从植物根际筛选有效的抗生素细菌也可以提供预防植物病害的替代手段。本研究和以往研究中共接种BCAs的病原体抑制作用的变化表明了植物、病原体和生防微生物之间复杂的相互作用。

PGPR和木霉能增强植物防御物质的活性，从而促进植物抵抗炭疽病

单独接种PGPR增加了植物防御酶（包括PPO、CAT和SOD）、叶绿素含量的积累和SA的产生。这有助于降低箭筈豌豆炭疽病的发病率和病情指数。Rais等（2017）发现Bacillus spp.增强了受侵染水稻（Oryza sativa）的抗氧化酶活性，从而减轻了氧化损伤并抑制了由毒性菌株Magnaporthe oryzae侵染引起的稻瘟病的发病率（Rais et al.，2017）。PGPR可以增加叶绿素含量，提高植物的光合效率（Yang et al., 2009; Mia et al., 2010）。作为植物全身获得性抗性（SAR）信号转导途径中的重要内源性信号，SA可以激活植物中的抗性机制（Jalmi 和 Sinha，2022 年）。在这项研究中，植物根际中的PGPR或长枝木霉参与诱导系统抗性的化合物（包括病原体相关蛋白和物质）共同作用减少了病原体的不利影响。接种PGPR或长枝木霉的植物中MDA含量的增加反映了这些植物中较高的氧化应激。

细菌群落结构和多样性主要受病原菌影响

植物叶际富含多种细菌群落（Andrews et al., 2000; Hirano & Upper，2000），这在箭筈豌豆中得到了证实，其叶际细菌属于14门154 属。关于PGPR和木霉对叶际细菌群落影响的知识很少。在我们的研究中，病原显著改变了叶际细菌群落结构和多样性，这与之前的研究相似（Díaz-Cruz & Cassone, 2022）。但PGPR和木霉的单独和联合接种对箭筈豌豆叶际细菌的多样性影响不大。

病原体入侵是影响植物叶际微生物多样性和组成变化的关键因素（Li et al., 2022）。在发病叶片的叶际中，金黄杆菌属（Chryseobacterium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）和假单胞菌（Pseudomonas）的丰度增加，而芽孢杆菌属（Bacillus）的丰度降低。研究表明，金黄杆菌属（Chryseobacterium）（Yin et al., 2021）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）（菌株SB-K88和C3）（Nakayama et al., 1999; Zhang & Yuen, 2000）对病原体有一定的抑制作用，假单胞菌（Pseudomonas）可以分泌抗病原菌的次生代谢物（Abadi等，2020），鞘脂菌属（Sphingobium）可以促进植物生长（Boss et al., 2022）。B. subtilis B931抑制病原菌的生长并利于植物健康（Ryder et al., 1999）。我们认为，当植物受到病原体的刺激时叶际中一些有益细菌相对丰度增加可能有助于抵御病害（Lebeis et al., 2015）。

PGPR和木霉对病害相关细菌富集的影响

有益微生物在植物抗病方面很重要（Van Wees et al., 2008）。PGPR和木霉对叶际细菌富集的影响因处理和健康状况不同而不尽相同。我们发现，接种PGPR的植株发病率最低，但叶际中的Kaistia属显著富集。Huang 等人（2012年）发现Kaistia adipata具有纤维素分解能力（Huang et al., 2012），这可能与植物免疫诱导有关（Wang et al., 2023）。在我们的研究中，Kaistia属是否有利于植物抗病还需要进一步验证。除Kaistia属的细菌外，同时接种PGPR和木霉的叶际中富集的属还有金黄杆菌属（Chryseobacterium）和黄杆菌属（Flavobacterium）。黄杆菌（Flavobacterium）可以持续抑制根部真菌病害（Carrión et al., 2019）。Kwak等（2018）发现Flavobacterium TRM1在抗性植物根际微生物组的含量远高于易感植物，而且它能抑制易感植物由Ralstonia solanacealum菌引起的病害的发生。这表明PGPR和木霉对叶际细菌富集的影响可能有助于植物的抗病性。要确定这些叶际细菌对植物侵染病原体的防御作用，还需要进一步的研究。

植物酶和激素信号物质与叶际细菌变化相关

植物的免疫反应可以改变叶际细菌群落（Schlechter et al., 2019）。在本研究中植物防御酶活性和激素物质（如PPO、NO和JA）与叶际细菌α多样性和属水平细菌的相对丰度有关。JA是一种植物激素和信号物质，在有益微生物诱导的信号转导中起关键作用（Carvalhais et al., 2015; Chen et al., 2020b），可调节植物微生物群，进而招募有益微生物（Delaney，1997）。有益微生物也作用于植物的免疫反应。接种了 PGPR 的健康植物叶际中不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度增加。Acinetobacter ALEB16诱导内源性植物激素SA的合成以抑制病原菌的生长（Wang et al., 2015）。SA诱导植物组织产生病程相关蛋白质，以响应病原体侵袭的压力，进而促进植物健康（Lebeis et al., 2015）。因此，我们认为接种PGPR和木霉后叶际有益细菌相对丰度的变化与植物防御物质有关，并且这些细菌反过来可能增强植物的防御反应以控制病害（图8）。

SEM阐释了PGPR、木霉和病原菌改变叶际细菌群落的机制与防御酶活性和信号分子密切相关，从而改变了植物和病原体等生态系统成分的相互关系。本研究表明，寄主植物、病原菌和有益微生物（如PGPR和木霉）之间的多重相互作用并不是简单的叠加效应，而是植物与微生物复杂相互作用的结果（图9）。

结论

本研究表明，接种PGPR（两种芽孢杆菌）和木霉增加了植物防御酶的活性和激素分子的含量，对被炭疽病侵染的箭筈豌豆具有保护作用。PGPR和木霉增加了病害相关叶际细菌的富集，这可能与植物防御酶（PPO）和信号分子（JA和NO）的活性有关。PGPR和木霉通过改变或调节植物防御物质降低了植物发病率，这与叶际细菌的相对丰度变化相关。我们认为PGPR和木霉引起植物防御反应导致一部分有利的叶际细菌富集，从而利于植物抵御病害。

PGPR和木霉在寄主植物中表现出的拮抗作用不利于植物的生长。这表明与单个菌株相比，用于开发生物防治联合的微生物可能导致多菌株混合物具有相同甚至更低的功效（Sarma et al., 2015）。据报道，PGPR和木霉在作物病害管理中发挥着积极作用（Arif et al., 2020; Penha et al., 2020），因此有必要开展进一步研究探索植物对功能性叶际微生物的复杂响应，并加深我们对在多物种相互作用中植物抗逆性的理解。

文章信息

原文链接：https://doi.org/10.1002/glr2.12081

引用格式：

Zhu, R., Yan, W., Wang, Y., Li, Y., Zheng, R., Dong, W., Yao, T., & Duan, T. (2024). Plant growth‐promoting rhizobacteria and Trichoderma shift common vetch (Vicia sativa) physiology and phyllosphere bacteria toward antagonism against anthracnose caused by Colletotrichum spinaciae. Grassland Research, 1–15. https://doi.org/10.1002/glr2.12081

排版：王亚娜

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