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引用本文
DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230332
陆保福，康文娟，师尚礼，等. 紫花苜蓿与根瘤菌共生过程中固氮效率的动态研究[J].中国草地学报,2024,46(6):36-48.
LU Baofu，KANG Wenjuan，SHI Shangli，et al.The study on dynamics of nitrogen fixation efficiency of alfalfa-rhizobia symbiosis[J].Chinese Journal of Grassland,2024,46(6):36-48.
紫花苜蓿与根瘤菌共生过程中固氮效率的动态研究
陆保福，康文娟*，师尚礼*，关键，景芳
甘肃农业大学草业学院
摘要 & 关键词
为明晰紫花苜蓿-根瘤菌共生系统固氮能力的动态变化及高效固氮的发生阶段，以甘农9号紫花苜蓿和苜蓿中华根瘤菌菌株LL11共生组合为研究对象，分析比较接种根瘤菌后紫花苜蓿生长42 d内不同共生阶段的根瘤形态结构、固氮能力、植物表型、可溶性物质含量、氮代谢关键酶活性等指标的动态变化，采用熵权TOPSIS综合评价法探寻共生过程中高效固氮的发生阶段。结果表明：（1）随着共生天数的增加，有效根瘤数、根瘤直径和根瘤重逐渐增大，42 dpi（Days post inoculation）有效根瘤数（9.3个）、根瘤重（0.0309 g）和根瘤直径（1.43 mm）达到最大；而根瘤内部被侵染的根瘤细胞数目呈先增后减的趋势，35 dpi根瘤内部被侵染的根瘤细胞数目最多（992个）；（2）35 dpi的固氮酶活性[0.9619 μmol/ (g·h)]、豆血红蛋白含量（2.6081 mg/g）、单株固氮潜力（0.0283 μmol·h-1）均显著高于其他共生时期（P<0.05）；（3）接种根瘤菌菌株LL11后，甘农9号紫花苜蓿的株高、根长、地上部和地下部干重均显著提升，并在21 dpi、35 dpi出现了两次增幅高峰（与对照组相比较），在42 dpi达到最大值；（4）根系中可溶性糖含量的最高值和最大增幅发生在21 dpi，而可溶性蛋白含量最高值和最大增幅发生在42 dpi；叶片和根系中的硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）这4类氮代谢关键酶活性均在35 dpi显著高于其他共生阶段（P<0.05）。通过熵权TOPSIS综合评价分析得出， 35 dpi为高效固氮发生阶段，之后固氮效率开始下降。
紫花苜蓿；苜蓿中华根瘤菌；根瘤；固氮动态；氮代谢关键酶
接菌后第35天的苜蓿（图片由作者提供）
苜蓿根部的接瘤情况（图片由作者提供）
苜蓿根部的接瘤情况（图片由作者提供）
紫花苜蓿是一种适口性好、营养价值高，能用于改善生态环境的优良豆科牧草。根瘤菌是能与豆科植物建立共生关系的革兰氏阴性杆状菌，在共生过程中能形成新的固氮器官—根瘤和茎瘤。在根瘤菌与苜蓿互作的整个共生过程中，存在侵染、结瘤、固氮、衰老等不同共生阶段。不同共生时期内固氮能力存在差异。接种根瘤菌后，共生系统的固氮能力先缓慢上升，大约40 dpi（Days post inoculation），根瘤基部细胞开始出现衰老特征，导致固氮能力逐步下降。在前期研究基础上，本试验以甘农9号紫花苜蓿为材料，通过接种匹配性较强的苜蓿中华根瘤菌菌株LL11，形成共生系统后，分析比较接种根瘤菌42 d后不同共生时期的根瘤形态结构、固氮能力、紫花苜蓿的表型、可溶性物质含量、氮代谢关键酶活性等指标，阐明共生过程的固氮动态变化，明确高效固氮发生阶段。
01 材料与方法
1.1 试验材料
采用DS处理法对种子进行灭菌处理：碘伏浸泡5 min，无菌水冲洗，ST液浸泡1 min，无菌水冲洗。每个培养皿放置20粒灭菌后的种子，置于28℃恒温恒湿无光照培养箱中进行催芽处理。待2 d后，将发芽的种子置于水培装置，再次筛选，生长7 d后筛选出根部未结根瘤（即无内生根瘤菌）的幼苗，装入底部有小孔的育苗盘中，进行单株种植，表面覆盖约1.5 cm灭菌细沙。将育苗盘放入底盘中，种植当天向底盘中添加200 mL Hoagland有氮营养液，在植株生长期间每隔5 d浇灌300 mL Hoagland无氮营养液，水分缺乏时用蒸馏水补足，保证幼苗的正常生长。将幼苗置于人工气候室中，光照16 h/d，昼夜温度分别为（25±1）℃和（20±1）℃，相对湿度50%。
将保存于−80 ℃冰箱的根瘤菌菌株LL11接入TY液体培养基，于28 ℃、180 r/min振荡培养18~20 h，然后在4 ℃，10000 r/min条件下离心10 min，弃上清液后加入等量无菌水洗下菌体，振荡摇匀，配置成等体积且OD600nm为0.5的菌悬液（浓度为109 CFU/mL）。幼苗苗龄9 d时，使用移液枪向每株幼苗根部浇灌5 mL菌悬液，单独接种等量无菌水处理为对照。接菌处理和对照处理均设置5个育苗盘作为重复，接菌次数重复3次。接种后浇灌300 mL无氮营养液，每隔5 d浇灌一次，分别在接种后第0、7、14、21、28、35、42 d取样。
采用Excel 2019软件进行数据整理，统计分析中用平均值和标准误表示测定结果，运用SPSS 27.0统计软件对数据进行方差分析，采用GraphPad Prism 9.5.1软件作图。利用熵值权重法计算各指标所占权重，再通过TOPSIS法进行综合评价排序。
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02 结果与分析
2.1 共生时期根瘤形态结构动态
2.2 共生时期根瘤固氮能力变化动态
如图4-a所示，接菌处理组的株高呈指数增长，各共生时期的株高差异显著（P<0.05）。如图4-b所示，根长的变化趋势与株高相比较为平缓，除0 dpi外，其余各共生时期接菌处理组中苜蓿的根长均高于对照组，42 dpi达到最高，与各共生时期差异显著（P<0.05）。
2.4 共生时期根系中可溶性物质含量动态
由图7可知，NR、NiR、Fd-GOGAT、GS整体上都呈先升高后下降的趋势，且接菌组均显著高于对照组（P<0.05）。叶片中NR在0~35 dpi呈不断上升的趋势，35~42 dpi NR活性有所降低，但降低幅度较小。接菌组NiR、GS的活性变化趋势大致相同，0~35 dpi呈现不断上升的趋势，35~42 dpi逐渐降低，二者在35dpi均达到最高值，与其他各共生时期差异显著（P<0.05）。接菌组Fd-GOGAT活性在0~28 dpi期间呈现波浪式变化，35 dpi达到最高值，与各共生时期差异显著（P<0.05）。
从图8可看出，接菌组均显著高于对照组（P<0.05）。随着共生时期的推进，4类氮代谢关键酶活性呈现出先上升后下降的趋势，这与叶片中的4类氮代谢关键酶活性的变化大致相同。在图8-a中，接菌组NR酶活性在35 dpi达到最高。图8-b中接菌组NiR活性在0~35 dpi期间逐渐上升，35~42 dpi NiR活性逐渐降低，但降低幅度较小。图8-c反映了GS活性变化，0~35 dpi接菌组GS活性逐渐升高，在35 dpi酶活性最高，与其他各共生时期差异显著（P<0.05），35~42 dpi开始下降。图8-d中接菌组NADH-GOGAT在0~35 dpi呈现不断上升的趋势，35~42 dpi逐渐降低，在35 dpi达到最高，与其他各共生时期差异显著（P<0.05）。
2.6 熵权TOPSIS综合评价
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03 结论
制作：胡晓然
校对：奇立敏
审核：胡卉芳
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