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引用本文
DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230243
旦真措，郭雨寒，李聪，等. 紫花苜蓿毛状根高效转化体系的建立[J].中国草地学报,2024,46(6):95-102.
DAN Zhencuo，GUO Yuhan，LI Cong，et al.Developing a hairy root transformation system for alfalfa[J].Chinese Journal of Grassland,2024,46(6):95-102.
紫花苜蓿毛状根高效转化体系的建立
旦真措1，2，郭雨寒1，李 聪1，李 赫1，贾 磊1，刘 信1，于爱灵1，张佳怡1，丛丽丽1，*
1.青岛农业大学草业学院/黄河三角洲草地资源与生态国家林业和草原局重点实验室 2.鄂尔多斯市农牧业科学研究院
摘要 & 关键词
紫花苜蓿是我国草食畜牧业首选的优质多年生牧草，为摆脱种子的进口依赖亟须加快苜蓿基因功能研究和生物育种进程，而建立高效、周期短的遗传转化体系是前提。目前常用的苜蓿叶盘转化法转化周期长、转化难度大，不适用于初期的基因功能鉴定和CRISPR/Cas编辑效率评价等研究。因此，本研究以“无棣苜蓿”的胚根为外植体材料，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（MSgene72216）为Marker基因，将其构建的过表达载体pCAMBIA3301转入发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）Ar.1193菌株中诱导毛状根，经过共培养、二次切根、选择培养等过程获得毛状根转化植株后，通过PCR进行毛状根转化效率检测。结果表明：该方法可在2~3周获得用于鉴定的毛状根植株，大幅缩短了转化周期，其生根率可达100%，毛状根遗传转化率可达 98.33%。该体系的建立对高通量开展基因功能研究提供了省时省力高效的转化方法，为推动紫花苜蓿基因功能研究和生物育种奠定了基础。
紫花苜蓿；毛状根；发根农杆菌；遗传转化
图片由作者提供
近年来，紫花苜蓿根癌农杆菌介导的叶盘法转化体系已在多个实验室成功建立起来，但因周期长、效率不稳定等因素，其对研究根部相关基因功能和评价基因编辑体系具有耗时长、风险大等缺点。而毛状根遗传转化是一种较高效的转化方法，尤其是对于一些根癌农杆菌转化不亲和、转化效率低的植物而言，是较为理想的转化技术，可以弥补根癌农杆菌介导的遗传转化周期长、效率不稳定等问题。近年来，发根农杆菌介导的毛状根遗传转化体系已成功应用于蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、大豆（Glycine max）、花生（Arachis hypogaea L.）、箭筈豌豆（Vicia sativa L.）、鸭茅（Dactylis glomerata L.）、菠菜（Spinacia oleracea L.）等植物中。在紫花苜蓿中，、有研究通过侵染苜蓿叶片获得转化率为59.7%~67.9%的毛状根，但获得的毛状根因没有完整的茎叶结构无法独立生长，毛状根必须再进行愈伤培养才可成苗，整个再生周期约7~9个月。因此，本研究拟开发一套高效快捷的紫花苜蓿毛状根遗传转化体系，约2~3周可获得毛状根植株。该方法的建立可用于基因编辑效率评价，为紫花苜蓿高效基因编辑体系的建立提供快捷直接的评价方法，同时也可为紫花苜蓿基因功能研究和生物育种提供新的转化手段，是现有紫花苜蓿转化方法的重要补充。
01 材料与方法
1.1 试验材料
为了验证毛状根遗传转化效率，克隆参与苜蓿-镰刀菌互作相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（MSgene72216）作为体系的Marker基因。通过已完成测序的新疆大叶序列，设计克隆引物。选取无棣苜蓿叶片，提取总RNA，将提取的总RNA反转录为cDNA，进行基因PCR扩增。
用Nco I和BstE II限制性内切酶对过表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，扩增产物和酶切产物通过电泳检测后，进行切胶回收。用无缝克隆试剂盒将载体和Marker基因的回收产物连接，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α后在LB固体培养基（50 mg/mL Kan）上涂板，37℃过夜暗培养，挑选阳性单克隆测序，测序正确后提取质粒。将阳性重组载体转入发根农杆菌Ar.1193菌株中，并通过TY+ 10 mg/L Rif + 50 mg/L Kan固体培养基筛选阳性单克隆，PCR验证的阳性单克隆转接于5 mL TY+10 mg/L PPT+ 50 mg/L Kan的液体培养基中，28℃摇床培养1~2 d，将活化好的菌液于－80℃冰箱保菌备用。
本试验中以“无棣苜蓿”发芽的无菌幼苗为转化材料，进行切根侵染。为了更高效地进行毛状根遗传转化，防止幼苗在生长过程中因农杆菌的污染导致死亡，本试验通过对影响转化效率的农杆菌制备与侵染、种子发芽时间这两个影响转化效率的重要因素进行优化。农杆菌侵染分别设计了液体菌液侵染和菌板侵染两种方式，其中菌液侵染又设计了OD600值梯度分别为0.3、0.5、0.7和0.9；苜蓿发芽天数设计为2 d、3 d、4 d和5 d，采用双因素正交试验设计，确定最佳侵染方式和最佳发芽时间，每个试验组设3个重复，每个重复20株。
将侵染后的幼苗放在m-Fahraeus共培养培养基上，在25±1℃、16 h光照/8 h、黑暗光照强度 100 μmol/（m2·s）的光照培养箱中竖直培养7 d。将二次切根后的植株转入含选择培养基（m-Fahraeus+ 2mg/L PPT）的方皿中在培养箱中竖直培养7~10 d。1~2周后，将幼苗根上的琼脂在流水下小心并且彻底的洗除，通过水培培养，用于毛状根植株的阳性苗鉴定。
通过PCR进行阳性毛状根的鉴定，计算遗传转化效率。
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02 结果与分析
2.1 Marker基因克隆与载体的构建
2.2 发根农杆菌与种子发芽天数的优化
2.3 紫花苜蓿毛状根遗传转化最优体系的建立
通过优化后的体系转化毛状根，统计60株转化植株在二次切根后可长出毛状根的株数，计算毛状根的生根率和遗传转化率。结果显示，毛状根的生根率为100%，毛状根的遗传转化率98.33%（图3）。
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03 结论
制作：胡晓然
校对：陶彦彤
审核：胡卉芳
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