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由于基因的多效性，作物改良经常受到在产量和质量之间权衡的困扰。控制农艺性状关键基因的突变可能会引起不同表型之间潜在的拮抗作用，产生对农作物不利甚至致死的表型。近年来，顺式调控元件（CREs）的分子编辑为作物改良提供了另一种有效途径，其通过特异性微调靶基因表达来克服基因的多效性。CREs的分子操作为改变基因表达的时空模式、水平和环境响应特性提供了更多的可能性，有助于在分子作物育种中改良特定性状。因此，对于关键基因核心顺式调控元件区域的鉴定是必要的。近日，四川师范大学生命科学学院曾子贤/朱博教授团队在aBIOTECH 发表了题为“Developing a pipeline for identification, characterization and molecular editing of cis-regulatory elements: a case study in potato” 的研究论文。研究在马铃薯中建立了一个技术流程，利用开放染色质来预测候选CREs，通过瞬时转化和遗传转化实验来验证CREs的功能，并利用CRISPR/Cas9系统编辑CREs。
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作者以调控马铃薯结薯的关键基因StCDF1为对象，首先利用前期获得DM 1-3叶片的DNase-seq数据，鉴定到了一个288bp横跨StCDF1 5' UTR及其上游的DNase I超敏位点（T#01）(图1A)；接着构建了两组功能验证载体，一组包含luciferase (LUC) 报告基因用于烟草瞬时转化，一组包含β-glucuronidase (GUS) 报告基因用于马铃薯遗传转化 (图1B)。烟草瞬时转化结果显示T#01具有启动子活性，且活性在短日照下比长日照下更强 (图1C-E)。马铃薯遗传转化结果显示T#01在马铃薯幼苗叶片、茎和根中都具有活性，同时在块茎中经过短日照培养2周后，与长日照T#01相比具有更强的活性，且GUS表达水平差异显著，进一步证实StCDF1表达对光周期的敏感性 (图1F-H)。为了进一步评估T#01在体内的调控作用，作者利用CRISPR/Cas9技术获得了具有两个缺失的纯合编辑系。在长日照和短日照条件下，野生型 (WT) 和纯合CRISPR/Cas9编辑系 (t#01) 中StCDF1的表达模式都呈现出相似的昼夜节律。但是，在两种光周期条件下，相比于WT，t#01中StCDF1的表达水平在检测的时间点都显著降低 (图1I-K)。此外，t#01中的缺失延迟了块茎形成时间，在长日照和短日照条件下分别延迟了大约6天和5天 (图1L-M)。图1 StCDF1上游顺式调控元件的鉴定、验证和分子编辑综上所述，该研究利用开放染色质、瞬时转化和遗传转化实验以及CRISPR/Cas9系统，在马铃薯中建立了一套用于顺式调控元件鉴定、验证和分子编辑的技术流程。该流程包含4个步骤：(1) 利用DNase-seq、MNase-seq和ATAC-seq检测开放染色质的策略进行CREs全基因组预测；(2) 利用LUC报告系统通过烟草瞬时转化进行候选CREs功能的快速验证；(3) 利用GUS报告系统通过遗传转化实验进行CREs活性和组织特异性评估；(4) 对CREs进行分子编辑，检测基因的表达及表型（图2）。
图2 顺式调控元件鉴定、验证和分子编辑的流程图
该研究得到了国家自然科学基金和四川省科技计划等项目的资助。四川师范大学生命科学学院硕士研究生万敏和谢菡萏为本文的共同第一作者，四川师范大学生命科学学院曾子贤为通讯作者，该团队的硕士毕业生郭宏伟，青年老师景晟林、曾德英、朱博教授，四川省农业科学院作物所李兵参与了该研究。
Wan, M., Xie, H., Guo, H. et al. Developing a pipeline for identification, characterization and molecular editing of cis-regulatory elements: a case study in potato. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00185-1
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