农杆菌介导的转化（AMT）是植物和真菌生物技术中不可或缺的工具，但在大多数植物物种中，高效转化仍然是基因工程的一个相当大的瓶颈。几十年来对AMT的优化包括诱导条件、根癌农杆菌菌株和毒性基因（vir）的改进，提高了许多植物物种的AMT效率。即使有了这些改进，大多数遗传背景的转化效率仍然很低，限制了基因工程项目的规模，这表明需要改进工具来更好地控制和增强AMT过程。目前，对于AMT的许多改进都集中在改变vir或T-DNA内的序列上，而对二元载体骨架本身的工程研究相对较少。二元载体由一个T-DNA区、一个细菌选择标记和一个复制起始点组成，使质粒能够在农杆菌中适当地复制和维持。研究表明，ORIs（介导质粒复制的整个DNA序列，包括复制起始和反式作用因子）决定寄主范围和拷贝数，会影响植物的AMT效率。为了评估质粒拷贝数对AMT的影响，需要高通量筛选来鉴定和表征拷贝数变体。到目前为止，还没有一种普遍适用的方法可以应用于不同的ORIs来系统地筛选拷贝数多样性。近日，国际著名期刊Nature Biotechnology在线发表了一篇题为“Binary vector copy number engineering improves Agrobacterium-mediated transformation”的文章，该文作者利用高通量生长偶联选择试验来快速鉴定影响拷贝数的ORI突变，在烟草中使用瞬时表达分析来快速筛选可以提高AMT效率的突变体。![]()
研究表明，影响RepA蛋白的突变可以改变不同ORIs，包括pSC101、BBR1、RK2和pVS1的质粒拷贝数。作者首先利用这一特性，使用错配聚合酶链反应（epPCR）对pVS1、pSa、RK2和BBR1 ORI的整个repA开放阅读框（ORF）进行随机诱变。对于每个ORI，将这些突变的ORF构建到选择载体中，每个ORI汇集约100000个菌落，在根癌农杆菌C58C1菌株中创建四个突变文库。为了在这些文库中选择拷贝数较高的变异，作者使用了将质粒拷贝数与细菌抗生素耐受性相结合的定向进化试验（图1）。在4个ORIs中， pSa、pVS1、BBR1和RK2分别在38、118、126和150个核苷酸位置上富集2倍以上。与未选择的对照相比，在选择群体中显著富集的突变被认为与高拷贝数表型相关。
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图 1 定向进化产生质粒拷贝数变异
对于给定的ORI，创建了由驱动绿色荧光蛋白（GFP）的组成植物启动子组成的相同二元载体，该载体在repA ORF中由一个与所选突变对应的单核苷酸多态性（SNP）变化。将这些载体转化为大肠杆菌EHA105菌株，并在本氏烟中进行瞬时表达实验，筛选单个repA snp的影响。作者筛选了所有来源的71个候选物种，并确定了所有四种ori的突变体，这些突变体相对于它们的WT显著增加了GFP表达（图2）。![]()
图 2 筛选RepA突变体以改良本氏烟瞬时转化
为了评估烟草瞬态筛选的结果是否可以转化为植物和真菌的稳定转化系统，作者对拟南芥（a.thaliana）和圆叶拟南芥（r.t oruloides）进行了稳定转化实验。在卡那霉素培养基上选取约26,500粒种子，测定植株的总恢复率。pVS1 R106H突变体比WT pVS1的稳定转化效率提高了60%。RK2和pSa的提高更为显著，分别达到2800%和280%，但总转化效率低于pVS1。第二高表达和第三高表达的pVS1突变体的稳定转化增加了35%和24%（图3）。![]()
图3 二元载体突变体提高了植物和真菌的稳定转化
总的来说，作者创建了一个来自单个repA snp的拷贝数变异工具包，可以成功地影响植物瞬时表达水平，提高植物和真菌系统中的稳定转化，扩大和完善对AMT关键过程的控制。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02462-2
来源： 植物生物技术Pbj
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