药学院仪器测试中心质谱组学平台
摘要
基于氟的特殊性质，氟和含氟官能团在医药、农业等方面都有重要的作用。其中，向药物分子中引入氟甲基可以提高分子的活性和生物利用度。氟甲基存在于多种抗肿瘤、抗炎药物。复杂药物分子高特异性的氟甲基化是化学合成中的挑战。生物催化因其优良的特异性和温和的反应条件而具有独特优势，近来已被用于氟甲基转移反应。然而，目前报道的方法主要通过SAM依赖的亲核性甲基转移酶和氟甲基SAM类似物催化O,N,S等原子亲核氟甲基化，而对于不活泼碳的氟甲基化因十分困难而尚未实现。
近日，天津大学化工学院董敏教授团队在前期酶促亲核机制的氟甲基、氟乙基工作基础上（ACS Catalysis. 2023, 13, 13729；2024, 14, 6211），与合作者在Angew. Chem. Int. Ed.杂志上发表了题为“B12-Dependent Radical SAM Enzymes Catalyze C-Fluoromethy-lation via a CH2F-cobalamin Intermediate”的研究论文。该研究实现了B12依赖的SAM自由基甲基转移酶（B12-RSMTs）催化的自由基氟甲基化反应。发现酶通过识别原位产生的非天然辅因子F-SAM，生成5´-脱氧腺苷（5´-dA）自由基，同时在一种全新的氟甲基B12（CH2FCbI）中间体的参与下，实现了不活泼碳氟甲基化修饰，并成功应用于多肽、活性天然产物的特异性氟甲基化。
研究内容
QCMT属于B12依赖的SAM自由基甲基转移酶，它参与甲基辅酶M还原酶（MCR）418位谷氨酰胺Cα的甲基化后修饰。作者通过HMT原位产生SAM的甲基被氟甲基取代的氟代SAM（F-SAM），发现当使用柠檬酸钛（Ti(III) citrate）为还原剂时，QCMT可以还原性切割F-SAM产生5´-dA，同时在361nm下检测到新峰的生成。通过高分辨质谱、19F-NMR及X-单晶衍射表明该新峰为全新的中间体氟甲基B12（CH2FCbI）。此外，还检测到QCMT催化多肽底物PS24中谷氨酰胺Cα氟甲基化的产物（图1）。
图1：HMT与QCMT级联氟甲基化反应。
（A）在254nm下检测QCMT切割F-SAM的HPLC分析。
（B）在361nm下检测CH2FCbI形成的HPLC分析。
（C）CH2FCbI的X单晶衍射分析。
（D）HMT与QCMT级联氟甲基反应用胰蛋白酶酶解后的MS/MS分析。
（E）负对照组用胰蛋白酶酶解后的MS/MS分析。
作者通过对QCMT催化的氟甲基反应进行实时UV-vis监测、LC-MS分析及时间依赖的HPLC分析等，推测了HMT与QCMT级联氟甲基化的反应机理：首先，HMT催化SAH与CH2FI反应生成F-SAM，QCMT中的铁硫簇被还原为一价后传电子给F-SAM，使其均裂产生5´-dA自由基，进而夺取底物上的氢原子，产生底物自由基；同时QCMT中的钴胺被还原为一价并亲核进攻CH2FI，产生氟甲基B12；氟甲基B12与底物自由基发生自由基取代反应后，生成氟甲基产物与二价钴胺素，二价钴胺素被还原为一价后继续进行下一轮催化（图2）。
图2：推测的HMT与QCMT级联氟甲基化反应机理。
接下来，作者将氟甲基级联反应运用至其他的B12-RSMTs：CysS与GenD1。CysS参与天然产物Cystobactamids的生物合成，在HMT与CysS的级联反应中，获得氟甲基化产物-化合物4。GenD1参与天然产物庆大霉素的生物合成，在HMT与GenD1的级联反应中，获得氟代的庆大霉素X2（图3）。
图3：（A）HMT与CysS级联反应中氟甲基产物的LC-MS分析。
（B）HMT与GenD1级联反应中DNFB衍生化的氟甲基产物的LC-MS及MS/MS分析。
最后，作者发现F-SAM对于氟甲基化反应并不是必须的，当用SAM代替F-SAM并加入CH2FI仍然可以产生氟甲基产物，这进一步验证了之前提出的反应机理。
该工作拓展了SAM自由基酶的应用范围，为高选择性制备更多的氟烷基天然产物提供了创新方法。
致谢
天津大学博士研究生孔丽媛为论文的第一作者，天津大学董敏教授为论文的通讯作者，盈科瑞（天津）创新医药研究有限公司扈靖博士为共同通讯作者，同时感谢药学院高妍老师在质谱检测方面提供的帮助!
原文链接：
https://doi.org/10.1002/anie.202419815
在该研究工作中，药学院仪器测试中心质谱组学实验室提供了小分子和多肽的液质（LC-MS及LC-MS/MS）测试和数据分析。
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图文来源：天津大学化工学院董敏团队
图文编辑：天津大学药学院仪器测试中心团队
审核：陈瑞冰 张向阳 高妍
