pCB12弹性纳米脂质体的经皮递送及抗炎作用

时尚 2024-12-21 12:00 上海

来源

弗图谈美

作者｜任传鹏，马彦云等

翻译｜豆豆

编辑｜木朵

摘

要

● ●

棕榈酰乙醇胺（PEA）具有多种护肤功能，如抗伤害和抗炎作用。然而，由于其难以绕过角质层屏障、相对低的生物利用度和低稳定性，其局部应用受到限制。本文利用弹性纳米脂质体（ENLs）作为一种新型的药物递送系统，将PEA包裹在其中，以克服上述问题并增强对皮肤的生物效应。用磷脂酰胆碱、胆固醇和十六烷基-PG羟乙基棕榈酰胺以模拟皮肤表皮脂质的摩尔比制备ENL，并加载PEA。PEA-ENL具有高效的透皮给药和增强的皮肤保留，对HaCaT细胞的细胞毒性可忽略不计，在人体皮肤贴片试验中无过敏反应。值得注意的是，PEA-ENL处理增加了细胞迁移并诱导了与抗伤害感受、抗炎和皮肤屏障修复相关的基因表达的显著调节。通过分子对接位点分析，进一步探讨了PEA的镇痛抗炎作用机制。这种新型PEA-ENL具有高效的透皮递送效率和多种护肤功能，有望用于局部应用。

关键词：棕榈酰乙醇胺;弹性纳米脂质体;透皮给药;抗伤害性;抗炎;瞬时受体电位香草酸亚型1

引言

棕榈酰乙醇胺（PEA），也称为paltitamide MEA，是一种广泛存在于哺乳动物细胞和组织中的脂质酰胺[1]。PEA属于N-酰基乙醇胺（NAE）脂肪酸酰胺家族，具有疏水性，分配系数（LogP）为5.74 [2]。作为一种营养药物，一些临床前和临床研究表明，PEA具有多效性临床益处，包括抗炎、抗菌、镇痛、解热和神经保护作用[3-6]。这些治疗效果可以通过影响多种途径的PEA机制实现，包括靶向核受体过氧化物酶体增殖物实现的α（PPARα）、G蛋白偶联受体55（GPR 55）和G蛋白偶联受体119（GPR 119）[4，7]。作为内源性大麻素（eCB）样脂质介质[8]，PEA可通过抑制大麻素（AEA）的降解间接激活大麻素受体1和2（CB 1和CB 2）[2]。此外，一些研究表明，PEA可以通过抗伤害效应靶向瞬时受体电位香草素1（TRPV 1）[1，9]。此外，PEA可下调外周组织和中枢神经系统中的肥大细胞[10，11];因此，其在具有抗过敏活性的免疫中显示出非凡的性能[9]。

上市的大多数PEA药物均为口服给药，如人用Normast®、Pelvilen®和PeaPure® [12]。目前，PEA的镇痛抗炎作用已引起了人们的广泛关注。ysiogel AI®是一种含有PEA的乳膏，已上市用于临床治疗皮肤干燥和刺激[13]。虽然PEA已经显示出优异的治疗效果，但由于其水溶性差和有限的稳定性，其生物利用度受到显著限制。纳米药物递送系统为解决这些问题提供了一种解决方案。纳米尺寸的给药系统可通过皮肤表面粘附和角质层渗透有效地增强经皮给药。此外，将活性药物成分（API）加入到递送系统中可增加水溶性，增强稳定性，同时减少不希望的副作用的发生[14]。已成功开发了多种药物递送系统，包括纳米结构脂质载体（NLC）、固体脂质纳米颗粒（SLN）、脂质体、囊泡、纳米晶体和纳米球，用于真皮和经皮药物递送[14-16]。尽管上述给药系统已广泛用于局部应用，但其皮肤渗透效率相对较低[17]。弹性纳米脂质体（ENLs）是一种新型的由磷脂和表面活性剂组成的透皮给药系统，它不仅可以包裹亲水性和疏水性药物，而且脂质结构具有柔韧性和弹性。表面活性剂可赋予结构灵活性，这些囊泡的超变形性有助于比传统囊泡更深的皮肤渗透[18，19]。最近的一项研究证明了含ENL的醋酸生育酚的疗效，在体外和离体条件下均显示出优越的透皮渗透性[20]。这种增强的渗透性归因于ENL能够挤压皮肤屏障内的细胞间隙，从而有效地将活性化合物递送至靶向位点[20]。然而，由于表面活性剂的存在，在ENL的渗透过程中，皮肤屏障功能可能会受到阻碍。

在此，我们开发了一种新的ENL，其配方模拟角质层脂质比例，以增强角质层渗透效率，同时保持皮肤屏障功能。将具有抗伤害和抗炎作用的PEA进一步负载到ENL中以开发负载PEA-ENL（PEA-ENL）以实现多种护肤功能。基本角质层脂质，即，具有与皮肤生物脂质相似的摩尔比的神经酰胺、胆固醇和磷脂酰胆碱用于ENL制备。通过ENL包封，PEA的溶解性和稳定性得到改善，从而进一步提高生物利用度。此外，利用具有高变形性和弹性的纳米尺寸囊泡[21-23]，PEA-ENL表现出有效的透皮递送和增加的皮肤保留。进行PEA-ENL在人角质形成细胞（HaCaT）中诱导的体外药理作用以及人皮肤斑贴试验以评价其安全性。通过基因和蛋白表达及分子对接位点分析，阐明其护肤作用机制。这种负载PEA的ENL具有抗伤害和抗炎作用，显示出潜在的护肤应用。

结果

2.1.PEA-ENL的特性

使用高压均质化技术制备的优化PEA-ENL的流体动力学尺寸为155.8 ± 14.5 nm，使用DLS测量（图S1）。利用TEM观察PEA-ENL的形态并表征其直径。如图1a所示，观察到均匀分布的球形，表明使用高压均质化技术成功制备了PEA-ENL。基于TEM图像分析PEA-ENL的尺寸分布直方图。使用TEM测量的平均粒度（图1b）略小于使用DLS测量的流体力学粒度（图S1）：72.7%的PEA-ENL在50 nm至100 nm的粒度范围内，而11.5%的PEA-ENL在100 nm至150 nm的粒度范围内。尺寸分布结果表明，大多数PEAENL显示出适合皮肤表面粘附和角质层渗透的尺寸[32]。PEA-ENL的包封率为94.3 ± 0.8%，载药率为1.0 ± 0.4%。通过皮肤滞留分析和皮肤渗透过程可视化来确定PEAENL的经皮递送性质。图1c显示在局部施用24小时后，PEA-ENL组中保留在猪皮肤中的PEA的量是用游离PEA处理的组的2.8倍。为了进一步研究ENL在增强PEA经皮渗透中的作用，进行了体外经皮扩散试验。将荧光染料罗丹明B异硫氰酸酯（Rho B）作为示踪分子加载到ENL中。在不同的时间间隔局部应用后，通过使用荧光显微镜观察透皮给药过程。如图Id所示，在相同RhoB浓度下，RhoB-ENL处理组的红色荧光信号明显强于游离RhoB处理的对照（Ctrl）组，表明ENL可以有效地促进包封的货物的透皮递送和渗透到皮肤的更深层。使用ImageJ（V.1.44p，NIH，USA）进一步定量荧光信号的积分密度，并呈现在表S1中。

图1.PEA-ENL的特征：（a）PEA-ENL的TEM图像;（b）PEA-ENL的尺寸分布直方图;（c）用游离PEA和PEA-ENL处理猪皮24小时后的PEA皮肤保留。**:P < 0.01，差异无显著性;（d）用游离RhoB或RhoB-ENL（RhoB浓度相等）处理猪皮肤长达8小时的荧光显微镜图像;（e）用PEA-ENL（含10 µM PEA）处理的HaCaT细胞的细胞活力。数据表示为平均值±标准差，n = 3，**：p < 0.01，Student t检验。

为了消除PEA-ENL的安全性问题，进一步研究了体外细胞活力和人体中潜在的诱导过敏反应。使用HaCaT细胞评估含10 µM PEA的PEA-ENL的毒性。如图1 e所示，与对照组相比，在用PEA-ENL处理5天的HaCaT细胞中未观察到明显的细胞毒性。此外，为了评价其在人体中的潜在过敏反应诱导作用，进行了皮肤斑贴试验。共有32名志愿者（男性和女性人数相等）随机接受含0.020至0.025 g乳膏（含或不含PEA-ENL）的贴剂治疗24小时。观察揭除贴片0.5、24、48 h后的皮肤反应程度，并记录为不同的评分。如表1所示，在PEA-ENL治疗组或对照组的参与者中均未观察到过敏反应，证明了PEA-ENL的安全性。

表1.人体皮肤斑贴试验结果

综上所述，这些数据表明，平均直径为155.8 nm的优化ENL可以作为理想的载体，有效地包封PEA，并促进其透皮给药，在HaCaT细胞中的细胞毒性可忽略不计，对人体皮肤的过敏反应也不明显。

2.2.PEA-ENL对细胞迁移的影响

为了评价PEA-ENL在促进皮肤修复中的作用，使用两种人皮肤细胞系HaCaT和HSF进行transwell细胞迁移测定。用PEA（2 μg/mL）、含有等量PEA的PEA-ENL和空ENL（Ctrl-ENL）处理细胞。如图2a所示，在初始时间，所有组显示出相同的伤口距离。治疗24 h后，PEA和PEA-ENL组的伤口距离与Ctrl-ENL组相比显著缩短。迁移面积在图2b中进一步量化。与Ctrl-ENL组相比，用PEA和PEA-ENL处理的HaCaT细胞的迁移面积分别改变了2.7 ± 0.3倍（* p < 0.05）和2.8 ± 0.3倍（* p < 0.05）。如图2c、d所示，用PEA-ENL和PEA处理HSF细胞呈现出比对照-ENL组更大的迁移面积，分别增加4.0 ± 1.3倍（** p < 0.01）和3.8 ± 1.1倍（** p < 0.01）。值得注意的是，在两种细胞系中PEA和PEA-ENL组之间的差异不显著，表明ENL递送系统中的包封PEA适当地保持了其细胞增殖功能。这些结果表明，PEA-ENL处理24小时可有效促进HaCaT和HSF细胞的细胞迁移。

图2.细胞迁移试验：（a）处理开始时（0小时）和用Ctrl-ENL、PEA-ENL和PEA（2 µg/mL）处理24小时后HaCaT细胞的显微镜图像;（b）用Ctrl-ENL、PEA-ENL和PEA处理24小时后HaCaT迁移面积的定量;（c）在处理开始（0小时）和用Ctrl-ENL、PEA-ENL和PEA（2 µg/mL）处理24小时后的HSF显微镜图像;（d）用Ctrl-ENL、PEA-ENL和PEA处理24小时后，HSF的迁移面积的定量。n = 3。数据表示为平均值± SD。* ：p < 0.05，**：p < 0.01;方差分析;比例尺200 µm。

2.3.PEA-ENL在HaCaT细胞中的多靶点效应

为了研究PEA-ENL在HaCaT细胞中的作用，分析了CB 1、TRPV 1和TRPV 4的表达。与对照组相比，用PEA-ENL处理12小时后HaCaT细胞中CB 1的表达显著增加了5倍（图3a），而用PEA-ENL处理后观察到TRPV 1（图3b）和TRPV 4（图3c）的表达显著降低。这些数据表明PEA-ENL的施用在HaCaT细胞中显示出显著的抗伤害感受性质。

图3.处理后HaCaT细胞中的基因表达：（a）用Ctrl-ENL和PEA-ENL处理12小时后HaCaT细胞中CB 1的表达;（b）处理后HaCaT细胞中TRPV 1的表达;（c）处理后HaCaT细胞中TRPV 4的表达;（d）处理后HaCaT细胞中MMP 1的表达;（e）处理后HaCaT细胞中MMP 3的表达;（f）处理后HaCaT细胞中FLG的表达。n = 3。数据以平均值SD表示。* ：p < 0.05，**：p < 0.01，*：p < 0.001; student’s t检验。

有趣的是，与对照组相比，PEA-ENL处理后，基质金属蛋白酶包括MMP1(图3d)和MMP3(图3e)的表达下调，表明PEA-ENL处理有效抑制胶原降解。FLG在皮肤屏障功能和维持皮肤水合作用中的重要作用已被 FLG功能丧失与特应性皮炎之间的密切联系所证实。在本研究中，我们进一步评估了PEA-ENL对HaCaT细胞中FLG表达的影响。与Ctrl-ENL处理组相比，用PEA-ENL处理后，HaCaT中FLG的表达上调了3倍（图3f）。

2.4.PEA与HaCaT细胞TRPV 1通道的竞争性结合

辣椒素是一种TRPV 1激动剂，用于评估TRPV 1的功能表达。在本研究中，选择了1 µM辣椒素诱导HaCaT细胞中的钙内流。通过测定细胞内游离Ca 2+浓度的变化，研究PEA-ENL对TRPV 1通道的抑制作用。使用Fluo-4AM酯作为荧光团观察Ca 2+在HaCaT细胞中的积累。与对照组（图4a）相比，在辣椒素处理的细胞中观察到显著增强的荧光强度（图4 b）。相比之下，在加入含10 µM PEA的PEA-ENL后，观察到绿色荧光减少（图4c）。进一步定量荧光强度倍数变化。如图4d所示，辣椒碱的荧光强度比对照高73.61%，表明辣椒碱可显著促进Ca 2+积累（* p < 0.001）。加入PEA-ENL后，观察到与仅用辣椒素处理的细胞相比，荧光强度降低了13.28%，表明PEA-ENL显著降低了Ca 2+积累（#：p < 0.001，图4d）。

图4.辣椒素（1 µM）和PEA-ENL（10 µM）对细胞内Ca 2+流量的影响。分别用（a）对照、（b）辣椒素（1 µM）和（c）辣椒素（1 µM）与PEA-ENL（10 µM）的组合处理后的HaCaT细胞的共聚焦显微镜图像。(d)处理后HaCaT细胞荧光强度的定量分析。数据表示为平均值± SD，n = 8。与对照组比较，*：p < 0.001;与辣椒素比较，#：p <0.001; student’s t检验。

为了进一步研究PEA对HaCaT细胞中TRPV 1的调控作用，利用AutoDockTools软件模拟分析了辣椒素和PEA与TRPV 1的对接位点和对接分数。辣椒素（图5a）和PEA（图5 b）对TRPV 1蛋白质的分子对接得分分别为−7.8 kcal/mol和−6.7 kcal/mol。据报道[34]，TRPV 1激动剂辣椒素的分子对接结果表明，辣椒素与TRPV 1的残基Glu 570之间形成了强氢键。然而，与辣椒素等最常见的TRPV 1激动剂相比，PEA与TRPV 1之间的相互作用表现出截然不同的模式，主要体现在与分子形成氢键的残基上。

图5.（a）辣椒素和（b）PEA与TRPV 1的分子对接位点和位置（PDB ID：7LPB）辣椒素和PEA与TRPV 1结合的对接得分分别为−7.8 kcal/mol和−6.7 kcal/mol。TRPV 1蛋白质骨架表示为卡通。活性位点残基以棒状表示，其中碳为灰色，氧为红色，氮为青色。以蓝色棒表示的分子被对接到结合腔中。虚线表示分子间氢键。

总而言之，钙内流实验和分子对接分析表明，PEA可以竞争性地干扰辣椒素与TRPV1通道的结合。这些结果表明PEA-ENL通过竞争性结合头TRPV1通道有效抑制HaCaT细胞内钙水平，从而发挥潜在的抗伤害性感受作用。

2.5.PEA-ENL在HaCaT细胞中的抗炎作用

PEA-ENL在HaCaT细胞中的抗炎作用通过研究炎性细胞因子白细胞介素6（IL 6）和环氧合酶2（COX 2）的表达来评价PEA-ENL在HaCaT细胞中的抗炎作用。如图6a、b所示，与对照组相比，用PEA-ENL（10 μM）处理的HaCaT细胞显示出IL 6和COX 2表达的显著降低，表明PEA-ENL的抗炎作用。为了研究CB1激活是否诱导IL 6和COX 2表达下调，使用CB 1受体选择性拮抗剂AM 251（10 μM）。用AM 251处理后，用PEA-ENL（10 µM）处理的HaCaT细胞中IL6和COX 2的表达显着增强（图6c、d）。因此，这些数据表明PEA-ENL通过激活CB 1显示出有效的抗炎作用。

图6.处理12小时后HaCaT细胞中的炎症基因表达。（a）用Ctrl-ENL和PEA-ENL处理后IL-6的表达，（b）用Ctrl-ENL和PEA-ENL处理后的COX 2表达，（c）用PEA-ENL和AM 251处理后的IL 6表达，（d）用PEA-ENL和AM 251处理后的COX 2表达，和（e）PEA对CB 1受体的分子对接位点和位置（PDB ID：5 TGZ）。CB 1蛋白质骨架表示为卡通。活性位点残基以棒状表示，其中碳为灰色，氧为红色，氮为青色。PEA（以蓝色棒表示）停靠在结合腔中。虚线表示分子间氢键。数据表示为平均值± SD，n = 8。* ：p < 0.05，**：p < 0.01，*：p < 0.0001; student’s t检验。

AM 251表现出与CB 1结合的强能力。通过分子对接分析，结合分数高达−10.1 kcal/mol（见图S2）。如图 6e 所示，PEA 也精确地与 CB1 受体的结合口袋对接，并与口袋周围的蛋白质残基形成了强氢键。PEA 与 CB1 受体的对接分数为-7.3 kcal/mol（图 6e），表明 PEA-ENL 释放的 PEA 能够与 CB1 受体结合，从而发挥抗炎作用。这也表明，在 HaCaT 细胞中施用 AM251 会阻断 PEA-ENL 对 CB1 的作用。

讨论

PEA显示出潜在的抗炎和抗伤害性，有望用于局部应用[7]。提高有效护肤效果的挑战受到低生物利用度、低稳定性和克服角质层屏障的困难的限制。因此，需要采用药物递送系统来增强PEA的皮肤渗透性并改善其稳定性。与其他广泛使用的药物递送系统（如固体脂质纳米颗粒、纳米结构脂质载体、脂质体和纳米晶体）相比，ENL显示出更高的囊泡变形性，因此可以更有效地穿透角质层屏障[36]。变形能力是重要的，值得我们在后续的研究工作中进一步探讨。与物理渗透增强方法（例如，微针和电穿孔），ENL的使用是非侵入性的。因此，选择一种新型的递送载体ENL来负载PEA，以提高其生物利用度和稳定性，降低其副作用，并增强其透皮递送以达到期望的护肤效果。

ENL的大小在确定透皮递送效率中起着至关重要的作用。与更大的脂质体相比，直径为120 nm的脂质体显示出显著增强的API经皮递送至皮肤[37]。在本研究中，平均粒径为155.8 ± 14.5 nm的PEAENL显示出比游离PEA处理组更好的皮肤保留能力（图1c），表明将PEA包封到ENL中不仅可以改善PEA的透皮递送，而且还显示出在局部应用后保护包封PEA免受皮肤表面氧化和降解的潜力。此外，粒径相似的RhoB负载ENL表现出显著增强的透皮扩散速率和深层皮肤渗透性（图1d），这进一步证明了ENL作为新型透皮给药载体的能力。

为了探索PEA-ENL的皮肤药理作用，研究了两个有前途的治疗靶点CB 1和TRPV 1。先前的研究表明，CB 1的激活可以诱导抗伤害性作用，这可以被CB 1拮抗剂阻断[38]。TRPV 1，也称为辣椒素受体，属于瞬时受体电位（TRP）通道家族。TRPV 1受体可被热、物理和电化学刺激激活，并负责皮肤烧灼感和伤害性感觉[34，35]。关于HaCaT细胞中的体外实验，在用PEA-ENL处理后观察到CB 1表达的增加和TRPV 1表达的减少（图3a，B）。这些结果表明PEA-ENL处理在HaCaT细胞中的抗伤害感受作用。

为了进一步研究PEA-ENL作为TRPV 1拮抗剂的功能，研究并定量辣椒素诱导的钙内流。各种各样的环境刺激可以激活TRPV 1，导致Ca 2+和Na+从细胞外空间流入细胞质。在几项研究中研究了TRPV 1与皮肤敏感性的病理生理学相关性[35，36]。TRPV 1刺激能够延迟屏障恢复，而TRPV 1拮抗剂的施用改善屏障修复。感觉瘙痒、疼痛、温暖和化学刺激后的传出功能以及神经肽的局部释放也与TRPV 1激活有关[39]。我们的结果表明PEA-ENL在阻断辣椒素诱导的TRPV 1活化中的功能性（图3和4）。

CB 1不仅具有PEA诱导的抗伤害性作用，还具有PEA诱导的抗炎作用[40]，这一点在本研究中通过使用CB 1受体拮抗剂AM 251得到进一步证实。结果显示，一旦CB 1被阻断，在HaCaT细胞中用PEA-ENL处理不能有效抑制炎性细胞因子IL 6和COX 2的上调表达（图6）。这些结果证明PEA-ENL通过CB 1发挥作用。

结论

本研究开发了一种PEA负载ENL，并表征其功能。将PEA包封到由神经酰胺、胆固醇和磷脂酰胆碱制备的ENL中，其中神经酰胺、胆固醇和磷脂酰胆碱具有与角质层脂质几乎相等的摩尔比，以更好地保护皮肤屏障。与游离PEA相比，PEA-ENL显示出显著改善的透皮递送能力和增强的皮肤保留。PEA-ENL处理后，在HaCaT细胞中观察到显著的抗伤害和抗炎作用，主要通过调节CB 1和TRPV 1。因此，这种新型PEA-ENL有望作为治疗皮肤敏感性和老化的有效载体。虽然成本相对较高，但这种基于ENL的技术显示出其在精准护肤中局部应用的潜力，因为在精准透皮递送后针对特定药理学靶点选择分子将是皮肤问题和皮肤老化的有效治疗。

材料和方法

5.1.材料

氢化卵磷脂和聚乙二醇（PEG）-40氢化蓖麻油（CO 40）获自Sungwoo Chemical，Tokyo，Japan。胆固醇购自中国北京国药集团。戊二醇购自首尔的B&B。三辛基/癸酸甘油酯和硬脂基聚醚-21购自Croda，约克郡，英国。胎牛血清（FBS）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）、青霉素、链霉素、胰蛋白酶-EDTA和二甲亚砜（DMSO）购自Gibco，纽约，NY，USA。罗丹明B异硫氰酸酯（Rho B）购自Sigma Aldrich，St. Louis，MO，USA。Fluo-4 AM购自Yeasen Biotech Co.，有限公司、中国上海CCK-8测定试剂盒购自APE×BIO，Houston，TX，USA。

5.2.PEA-ENL的制备和表征

PEA-ENL使用高压均化技术制备。简言之，将0.127%（w/w）氢化卵磷脂、0.065%（w/w）胆固醇、0.1%（w/w）十六烷基-PG羟乙基棕榈酰胺、1%（w/w）PEA、20%（w/w）戊二醇和3%（w/w）辛酸癸酸甘油三酯在60 ℃下混合并搅拌，直至完全溶解，生成A相。接着，将2%（w/w）CO40和4%（w/w）硬脂基聚醚-21混合在一起以产生相B。将B相和A相混合，在60 ℃下搅拌以确保完全溶解后，向AB相中加入蒸馏水，在相同温度下搅拌至完全溶解，然后使用AMH-3微喷雾高压均质机（Antos Nanotechnology，Suzhou，China）在800 bar下均质，以制备PEA-ENL。将均化过程重复3次，以产生纳米尺寸颗粒并将它们更均匀地分散。最后，通过超滤（MWCO 3.5kDa，Amicon Ultra，Millipore，Billerica，MA，USA）在4000 rpm下纯化30分钟以除去未包封的PEA。除了将RhoB加入到相A中以代替PEA之外，按照与上述相同的方法制备负载RhoB的ENL（RhoB-ENL）。

使用Zetasizer/Nano-ZS 90仪器（马尔文Instruments，马尔文，UK），使用动态光散射（DLS）测量PEA-ENL的粒度和多分散指数（PDI）。PEA-ENL的形态用透射电镜（TEM，HT 7700，Hitachi，Tokyo，Japan）观察。将PEA-ENL用去离子水稀释400倍，滴在铜网上，用1%磷钼酸染色，并在TEM观察前风干。

采用高效液相色谱法（HPLC）（Shimadzu Instruments，哥伦比亚，MD，USA），使用Sepax Bio-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5.0 µm，300 Å，Suzhou，China），在紫外波长214 nm，30 ° C下测定PEA的含量。以甲醇/超纯水= 94/6（v/v）为移动的相。PEA的保留时间约为5.1 min，流速为1.0 mL/min，进样体积保持在10 µL。采用超滤离心法除去未包封的PEA，并使用以下公式计算PEA-ENL的包封效率（EE）和载药效率（DL）：

其中We是包封在纳米载体中的活性成分的质量，Wm是纳米载体的总质量，Wf是未包封在纳米载体中的游离活性成分的质量。

5.3.体外皮肤保留

皮肤组织取自BAMA小型猪（5-6 kg体重）的背部，具有未受损的毛囊，购自芝罘玉荣生物工作室（中国山东烟台）。采用Franz扩散池法考察PEA-ENL的透皮性能。简言之，BAMA猪皮固定在供应池和接收池之间，角质层朝向供应池。接着，将0.5mL PEA-ENL和0.5mL含有相同浓度PEA的游离PEA加入到供应池中，然后均匀地施加到BAMA猪皮上。

使用再循环水浴将Franz扩散池保持在37 ℃，并以300 rpm连续搅拌受体室中的PBS缓冲液（pH 7.4）。24小时后，取出皮肤并用2 mL甲醇研磨，超声处理10分钟，然后离心。过滤上清液并进行HPLC分析以计算每单位面积皮肤的PEA保留。

5.4.皮肤渗透的荧光显微镜观察

为了观察透皮渗透过程，将0.5mL具有相同RhoB浓度的RhoB-ENL或游离RhoB溶液加入到供应池中，并均匀地施加到BAMA猪皮上。在经皮渗透期间，在不同时间点（2小时、4小时和8小时）去除皮肤，并使用冷冻切片机（Thermo Scientific，HM 525 NX，中国上海）制备皮肤组织切片。使用荧光显微镜（IX 71，Olympus，Tokyo，Japan）观察RhoB在皮肤组织切片中的分布。

5.5.人皮肤斑贴试验

在人皮肤封闭斑贴试验中，将年龄在25至45岁范围内的16名男性参与者和16名女性志愿者随机分为两组，即PEA-ENL治疗组和对照组。接下来，将含有或不含有PEA-ENL的0.020至0.025 g乳膏装入贴剂（7 mm× 7 mm）中，用轻微的手掌压力施加到志愿者的前臂上，并用自粘胶带保护。在接触皮肤表面（约49 mm 2面积）24小时后，移除贴片，并从皮肤上清除残留样品。去除贴片后0.5、24和48小时评价皮肤刺激反应。根据《化妆品安全技术标准》（2015）记录皮肤反应评分。

5.6.HaCaT和HSF细胞的细胞培养

人角质形成细胞（HaCaT，中国科学院昆明细胞库）和人皮肤成纤维细胞（HSF，中国科学院昆明细胞库）在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。将细胞在37 ℃、含5%CO2的潮湿环境中孵育。HaCaT和HSF细胞在补充有10%FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养。所有细胞均在37 ° C下在5%CO2加湿培养箱中培养。收获用PEA-ENL处理的细胞用于进一步分析。

5.7.细胞活力测定

使用CCK-8测定评估细胞活力。简言之，将HaCaT细胞（1 × 10⁴个细胞/孔）在96孔板中培养24小时。除去培养基后，将不同浓度的PEA-ENL和辣椒素孵育24小时，然后向每个孔中加入10 μL CCK-8缓冲液，并在37 ℃下再孵育2小时。然后，使用酶标仪（Tecan Spark，Männedorf，Switzerland）测量450 nm处的吸光度。

5.8. 细胞迁移试验

将HaCaT和HSF细胞分别以每孔1 × 10⁶或4 × 10⁵个细胞的密度接种在6孔板中。在37 ° C培养24小时后，使用200 μL无菌移液器吸头在每个孔中的细胞上划直线，然后用无菌PBS洗涤三次以去除细胞碎片。接下来，用游离PEA或PEA-ENL以10 μM的相等PEA浓度处理HaCaT和HSF细胞。给予空ENL作为对照。在处理开始时（0小时）和处理后24小时在光学显微镜（MshOt，MF 52-N，中国广州）下拍摄受伤区域的照片。

5.9.RNA分离和定量实时PCR（qRT-PCR）

根据制造商的方案，使用HP总RNA试剂盒（Omega Biotech，斯坦福德，CT，USA）从细胞中分离总RNA。使用M-MLV第一链试剂盒（Life Technologies，盖瑟斯堡，MD，USA）用逆转录酶进行cDNA的合成。在ABI Prism 7900 RealTime PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上使用基于SYBR-Green的方法进行实时qRT-PCR。相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）标准化后测定mRNA的相对表达水平。

5.10.钙瞬变测定

HaCaT细胞在6孔培养板中培养24小时。除去培养基后，将1 μM辣椒素和10 μM PEA-ENL加入培养板中并孵育24小时。然后将细胞用Fluo-4 AM在37 ℃下染色1小时。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并使用荧光显微镜（Leica DMI 4000，韦茨拉尔，德国）拍照。荧光团在488 nm处激发，而在530 nm处获得发射。

5.11.分子对接位点分析

使用GaussianView [24]对PEA的结构进行建模，然后在Gaussian 16 [29]中使用M062 X [25-27]/LANL 2DZ [28]进行优化。优化后的结构被进一步导入到AutodockTools 1.5.6中。CB 1（PDB ID：5 TGZ）和TRPV 1（PDB ID：7 LPB）的蛋白质结构从RCSB蛋白质数据库（PDB）下载。随后，使用AutoDock 4.2.6 [30，31]软件包通过内置的半经验自由能评分函数进行分子对接。使用PyMol 2.3.0进行特异性相互作用模式分析。

5.12.统计

所有结果均显示为来自至少三次独立实验的平均值和标准偏差。采用独立两组检验或单因素方差分析（ANOVA）与Fisher最小显著差异（LSD）多重比较检验和双尾Student t检验进行统计分析。p值小于0.05被认为具有显著性。

文章链接：

https://doi.org/10.3390/pharmaceutics16070876

END

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