iMeta | 空军军医大学秦鸿雁/陈衍-肿瘤免疫治疗中新的髓系细胞免疫检查点

LTBR，肿瘤相关巨噬细胞新的免疫检查点

●  开发了基于iMOS免疫检查点筛选平台，并发现LTBR特异性的高表达在TAMs中；

●  LTBR⁺TAMs与LUAD分期、免疫治疗耐药性和预后密切相关；

●  LTBR通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号维持TAMs免疫抑制表型；

●  阻断TAMs中LTBR的表达可增强肿瘤免疫治疗疗效。

引  言

肺腺癌（LUAD）占肺癌发病率的40%以上，且死亡率高。越来越多的证据和我们以前的研究表明，免疫检查点抑制剂（ICIs）联合化疗治疗早期非小细胞肺癌可显著改善患者的无疾病复发生存期（EFS），提高病理完全缓解率（pCR），但ICIs单药的总体反应率仅为6.3%~26%，提示：揭示ICIs耐药机制和开发新型ICIs具有重要的临床意义。近年来肿瘤免疫微环境（TIM）在肿瘤的发生、进展和免疫治疗耐药性中发挥着至关重要的作用。但之前的多组学分析大多集中在肿瘤细胞上，而很少关注TIM。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TIM的主要细胞群，它不仅滋养肿瘤细胞，而且有助于形成肿瘤免疫抑制微环境（TISM），包括耗竭细胞毒性CD8⁺T细胞和招募免疫抑制细胞，如髓系来源的抑制性细胞（MDSC）、调节性T细胞（Tregs）等。最近的证据表明，TAMs参与包括pembrolizumab（PD1单抗）、avelumab（PDL1单抗）和ipilimumab（CTLA4单抗）等ICIs的耐药，提示靶向TAMs可能是一种具有前景的肿瘤免疫治疗策略。

淋巴毒素β受体（LTBR）作为肿瘤坏死因子受体超家族的成员，表达在基质细胞和髓系细胞，但在T或B淋巴细胞上几乎不表达。 LTBR可被两种配体激活：即活化的T、B和NK细胞释放的淋巴毒素（LT）异三聚体LTα1β2或活化的T细胞释放的LIGHT同源三聚体。最近的研究表明，LTBR参与淋巴结和脾脏中CD169⁺巨噬细胞的分化。在一项非肿瘤炎症研究中，Wimmer等人发现，T细胞衍生的LTα1β2通过激活巨噬细胞LTBR拮抗炎性信号，提示LTBR在巨噬细胞中可能发挥免疫抑制作用。然而，TAMs中LTBR的激活是否有助于TISM的形成，其潜在机制仍需进一步研究。

在本文中，我们通过综合分析免疫多组学数据和scRNA-seq数据开发了一个免疫检查点筛选平台iMOS（图1A），发现LTBR可能是TAMs的潜在免疫检查点，其高表达、扩增和低甲基化与LUAD不良预后相关。LUAD组织芯片免疫荧光染色显示，LTBR⁺TAMs的浸润与LUAD分期、免疫治疗失败和预后不良有关。机制上，LTBR通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号维持TAMs免疫抑制活性和M2表型。巨噬细胞特异性敲除LTBR通过阻断TAMs免疫抑制活性和M2表型抑制肿瘤生长并延长生存时间。此外，靶向TAMs递送LTBR siRNA可逆转TAMs介导的免疫抑制进而改善ICIs的治疗效果，如，增强CD8⁺T细胞的细胞毒性和抑制粒细胞样-髓系来源的抑制性细胞（G-MDSC）浸润。总之，我们的研究开发了一种免疫检查点筛选平台iMOS，并确定LTBR是TAMs新的免疫检查点，其通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号促进CD8⁺T细胞耗竭和G-MDSC募集，靶向LTBR⁺TAMs有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。

结  果

通过免疫评分筛选LUAD中的免疫相关基因

我们从TCGA公开数据库下载了522例LUAD病例的临床信息和基因表达数据，其中515例同时具有临床信息和基因表达数据，并依此进行深入分析。基于LUAD病例的基因表达数据，通过ESTIMATE算法获得LUAD患者的免疫评分，该免疫评分与LUAD患者的病理分级、TNM分期和总体生存期相关（图S1A-E），可用于预测LUAD患者肿瘤的恶性程度和预后。

基于免疫评分我们拟筛选出免疫相关基因，以揭示LUAD进展过程中的免疫决定因素（图S1F）。首先，我们将TCGA数据库中的515例LUAD病例分为免疫评分高和低两组。然后，鉴定出1380个差异表达基因（DEGs）（p<0.05，倍数变化>1.5）（图S1F，表S2）。此外，基因本体论（GO）分析表明，这些DEGs参与淋巴细胞活化、细胞因子产生的调节、免疫细胞活化等（图S1G）。通过京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析，这些DEGs的前三个富集途径包括巨噬细胞分化、白细胞介素-12（IL12）途径和细胞因子-细胞因子受体相互作用（图S1H）。上述结果表明免疫评分可用来筛查免疫相关DEGs。

利用LUAD队列筛选可信的免疫相关预后基因

为了研究免疫相关DEGs的表达是否与LUAD总生存期相关，我们对1380个免疫相关DEGs进行了生存分析。其中，395个免疫相关预后基因（IPG）与LUAD总生存期显著相关（图S2A，表S3）。此外，IPG被分为343个免疫相关有益基因（IBG，高表达与较长生存期相关）和52个免疫相关有害基因（IHG，高表达与较短生存期相关联）（图S2A）。有趣的是，我们发现IBG的相对平均表达水平随着存活时间的延长而增加，而IHG的相对平均表达水平则降低（图S2B，C）。此外，GO分析显示，395个IPG参与淋巴细胞活化、免疫反应、白细胞活化等（图S2D、E）。KEGG分析结果显示这些IPG参与TCR信号、细胞粘附和巨噬细胞分化（图S2F，G）。上述结果表明，395个 IPG基因可能通过调节免疫过程和相关信号通路影响LUAD的预后。

图1. iMOS分析揭示LTBR是LUAD中潜在的TAMs免疫检查点

（A）免疫多组分和scRNA-seq数据综合分析（iMOS）的工作流程。（B）基于GEO数据库中的肺腺癌（LUAD）队列，筛选出可信的免疫相关预后基因（cIPG），包括免疫相关有益基因（cIBG）和有害基因（cIHG），通过log-rank检验，p<0.05。热图显示了LUAD病例的cIPG表达和存活时间。（C）直方图显示淋巴毒素β受体（LTBR）的泛癌生存分析，深蓝色柱表明该基因的高表达与较短的生存期相关（p<0.05），红色柱表明基因的高表达与较长的生存期有关（p<05），而浅蓝色柱表明与生存时间无显著相关性。（D）瀑布图显示LUAD中cIPG前10个突变基因的突变分布。（E）气泡图表示cIPG的表达和CNV水平之间的关系。（F） 通过Pearson相关分析检测LTBR表达与其扩增之间的关联性。（G）Kaplan-Meier图显示，LTBR的扩增与LUAD的生存期低有关。（H）气泡图表示cIPG的表达和甲基化水平之间的关系。（I）热图显示LUAD患者中八个甲基化探针的结合频率和位置。（J）通过TCGA数据库分析原发性LUAD组织（n=515）和正常肺组织（n=59）中LTBR的相对水平。（K）通过蛋白质印迹法测定LUAD组织和邻近组织中LTBR的相对蛋白水平（n=6）。（L）通过TCGA数据库分析不同T期LTBR的相对水平。（M和N）通过分析人LUAD scRNA-seq数据，UMAP图（M）和直方图（N）显示LTBR在免疫细胞中的表达分布。DC：树突状细胞；TAMs：肿瘤相关巨噬细胞；NK细胞：自然杀伤细胞。（O）空间scRNA-seq分析显示LUAD中巨噬细胞和LTBR之间存在空间共定位。数据显示为平均值±标准误差*，p<0.05；**，p<0.01；***，使用非配对学生t检验（J和K）或Tukey多重比较检验（L）的单因素方差分析，p<0.001。

为了探讨TCGA队列中的这些IPG是否在其他LUAD队列中也具有预后意义，我们在PubMed、Scopus、MEDLINE和EMBASE数据库中检索了包含530例LUAD病例的四个队列，并从GEO数据库下载了相关数据（GSE8894、GSE13213、GSE43767以及GSE68465）。在395个IPG中，有51个基因被证实与GEO数据库中LUAD病例的临床预后显著相关（p<0.05）（表S4），表明它们在不同LUAD队列中的可信度，即可信的IPG（cIPG）。进一步的热图直观地显示了cIPG表达与LUAD病例生存时间之间的相关性。据此，cIPG被分为47个可信IBG（cIBG）和4个可信IHG（cIHG）（图1B）。值得注意的是，我们发现cIBG的相对表达水平随着存活时间的延长而增加，而cIHG的相对表示水平则随着存活时间延长而降低（图S2H，I）。此外，GO分析显示这些cIPG参与白细胞活化、细胞活化调节和免疫反应的正向调节（图S2J，K）。KEGG分析表明，这些cIPG参与了原发性免疫缺陷、造血细胞谱系分化和TCR信号通路（图S2L，M）。进一步泛癌生存分析显示LTBR、HSPD1、WHSC1和TAP2也与其他类型癌症的不良预后相关，表明这些分子在肿瘤进展中具有重要作用（图1C，图S2N，O）。

iMOS分析显示LTBR可作为TAMs的潜在免疫检查点

基于上述发现，我们进一步进行了iMOS分析，并研究了cIPG的单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异（CNV）和甲基化是否会影响LUAD预后。首先，SNV分析显示，cIPG的49个基因存在SNV改变（表S5）。Oncoplot图描绘了cIPG的前10个SNV高频基因（图1D）。IL16和造血细胞特异性Lyn底物1（HCLS1）的突变与LUAD患者的生存期低有关（图S3A，B）。cIPG的26个基因的CNV与其表达显著相关（FDR<0.05），其中LTBR扩增与其表达之间的相关性最高（图1E，F，表S6）。值得注意的是，LTBR扩增与LUAD的不良预后显著相关，暗示LTBR扩增可能会影响LUAD的进展（图1G）。甲基化分析显示，cIPG中41个基因的甲基化水平与其mRNA表达呈负相关（图1H）。此外，与LTBR的转录起始位点（TSS）和基因内部结合的五个甲基化探针（cg15784615、cg19476647、cg23079808、cg08740698和cg07648238）显示LTBR低甲基化与不良预后相关，提示LTBR甲基化在LUAD进展中起着至关重要的作用（图1I、图S3C、表S7）。因此，多组学分析表明，LTBR的扩增和低甲基化与LUAD生存期低有关， LTBR可能参与LUAD的进展。

为了进一步探索LTBR在LUAD中的潜在作用，我们首先利用TCGA数据库，分析了LTBR在正常肺和LUAD组织中的表达水平，结果显示LTBR在LUAD组织中表达较高，且与其配体LTα1β2而不是LIGHT的表达一致，表明LTα1β2/LTBR信号轴参与了LUAD的进展（图1J，图S3D）。同时，手术切除的LUAD中LTBR的蛋白水平明显高于肿瘤周围邻近组织（图1K）。此外，LTBR的表达与LUAD病理分级、T分期和N分期密切相关（图1L、图S3E）。进而，我们利用人类LUAD组织和正常肺组织scRNA-seq数据，发现LTBR的mRNA水平在TAMs中表达最高，且远高于其他肿瘤浸润的免疫细胞，甚至高于正常肺组织的巨噬细胞（图1M，N，图S4A，B），而其配体LTα1β2主要在T、B和NK细胞中表达（图S4C），表明LTα1β2/LTBR信号可能介导了淋巴细胞和TAMs之间的通讯。通过对小鼠LUAD组织进行FACS分析，TAMs中LTBR蛋白水平在所有免疫细胞中也是最高的（图S4D）。最后，LUAD空间scRNA-seq数据再次分析进一步支持了LTBR在TAMs中的特异性表达（图10，图S4E）。总之，我们的数据表明，LTBR可能是TAMs的潜在免疫检查点。

LTBR⁺TAMs与LUAD分期、免疫治疗失败和临床预后相关

由于LTBR主要在TAMs中表达，我们进一步研究是否LTBR⁺TAMs与LUAD分期之间具有关联。126例来自临床的LUAD组织芯片免疫荧光染色显示，LTBR⁺TAMs的浸润随着LUAD恶性程度的增加而增加（图2A-D）。重要的是，LTBR⁺TAMs的浸润可用于预测LUAD患者的总体生存期（图2E）。这些结果表明，LTBR⁺TAMs与LUAD分期和临床预后相关。

为进一步揭示LTBR⁺TAMs在TIM中的作用，我们分析了TCGA数据库中的522名LUAD患者，发现LTBR表达水平与TAMs、MDSC和中性粒细胞的浸润呈正相关，与CD8⁺T细胞浸润呈负相关，但与其他免疫细胞无显著相关性（图2F、图S5A-F）。上述证据表明，LTBR⁺TAMs可能参与了TISM的形成。众所周知，TAMs可以抑制T细胞的募集和激活，导致免疫治疗耐药。据此，我们进一步分析了来自两个随机临床试验（RCT）队列（OAK，样本数699例；POPLAR，样本数192例）的RNA-seq数据，这两个队列是目前接受ICIs治疗的非小细胞肺癌（NSLC）患者最大的转录组数据库。在接受阿特珠单抗治疗的患者中，ICIs治疗无效的患者的LTBR表达远高于治疗有效的患者（图2G）。此外，与LTBR表达较低的患者相比，接受抗PD-1单抗阿特丽珠单抗治疗的LTBR表达较高的患者预后较差（图2H）。重要的是，我们之前的TD-FOREKOW 的2期多中心随机对照试验队列（ClinicalTrials.gov:NCT04338620）招募了15名可切除的IIIA或IIIB期（T3N2）LUAD患者，然后对他们进行卡瑞利珠单抗联合化疗。其中，7名患者实现了主要的病理反应（MPR，定义为切除的原发性肿瘤标本和取样的区域淋巴结中存在≤10%的活肿瘤细胞），被认为是卡瑞利珠单抗联合化疗的治疗有效者。而8名未达到MPR的患者被视为治疗无效者。使用上述患者的手术切除的LUAD组织，免疫荧光分析显示，LTBR⁺TAMs在治疗无效者的LUAD组织中的浸润远大于治疗有效者（图2I）。结果表明，LTBR可用于预测免疫治疗反应和临床预后。

图2: LTBR⁺TAMs与LUAD分期、免疫治疗失败和临床预后有关

（A）LUAD组织芯片的免疫荧光染色。（B）显示了来自（A）的LUAD组织的代表性免疫荧光染色结果。（C和D）比较不同肿瘤分期（C）和病理分级（D）的LUAD患者LTBR⁺TAMs的浸润数量。（E）将来自（A）的LUAD患者分为两组：LTBR⁺TAMs的高浸润组（high）和LTBR⁺TAMs的低浸润组（low），并通过log-rank检验分析LUAD生存期与LTBR⁺TAMs浸润之间的相关性。（F）通过TIMER2.0网站分析LTBR表达与指定免疫细胞浸润之间的相关性。（G）在OAK和POPLAR免疫治疗队列中，比较了对阿特丽珠单抗治疗有反应或无反应的患者的LTBR相对水平。（H） 在OAK和POPLAR免疫治疗队列中，接受阿特丽珠单抗治疗的患者根据LTBR表达分为两组：高表达（high）组和低表达（low）组，其生存分析采用Kaplan-Meier法进行分析，并采用log-rank检验进行检验。（I） 免疫荧光染色用于比较TD-FOREKOW队列中免疫治疗有效者和无效者的LTBR⁺TAMs浸润数量。数据显示为平均值±标准误差；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001使用Tukey多重比较检验（C和D）或未配对学生t检验（I）。

LTBR⁺TAMs介导CD8⁺T细胞免疫抑制和G-MDSC的募集

为进一步探讨LTBR在TAMs功能中的作用，我们设计并筛选出敲低LTBR效率最高的siRNA，对siLTBR或对照siRNA处理的TAMs进行RNA测序（图S6A）。GSEA结果显示，LTBR的敲低抑制了参与趋化因子和趋化因子受体生物合成和T细胞耗竭相关基因的表达，包括C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL2、程序性细胞死亡配体1（PDL1）、精氨酸酶2（ARG2）和环氧化酶2（COX2），而FCγR介导的吞噬作用、MHC途径以及抗原加工和呈递相关生物过程没有显著变化（图3A、B、图S6B）。qRT-PCR结果显示，LTBR的敲除抑制了CXCL1、CXCL2、PDL1、ARG2、COX2、转化生长因子β受体1（TGFβR1）、集落刺激因子2受体β（CSF2RB）、甘露糖受体（MR）、IL10和转化生长因子β（TGFβ）的mRNA水平（图S6C、D）。同时，ELISA检测证实，LTBR的敲除降低了TAMs中CXCL1、CXCL2、IL10和TGFβ的分泌（图3C）。此外，蛋白印迹实验和FACS分析表明，LTBR的敲除抑制了TAMs中PD-L1、ARG2、COX2、TGFβR1、CSF2RB和MR的蛋白水平（图3D-G）。反之，激动性LTBR抗体（LTBR Ag）激活LTBR可促进CXCL1、CXCL2、PDL1、ARG2、COX2、TGFβR1、TGFβR2、CSF2RB、MR、IL10和TGFβ的表达（图3H、I、图S6E、F）。因而，LTBR介导的信号通路可调节CXCL1、CXCL2、PDL1、ARG2、COX2、TGFβR1、CSF2RB、MR、IL10和TGFβ的表达。

先前的研究报道：（1）CXCL1和CXCL2参与G-MDSC和M-MDSC的招募有助于TISM的形成; （2）PD-L1、ARG2、COX2、TGFβR1和CSF2RB参与TAMs的T细胞耗竭和介导免疫抑制; （3）MR、IL10和TGFβ是M2型巨噬细胞的标志物。为进一步研究LTBR是否有助于TAMs招募MDSC，我们对G-MDSC和M-MDSC进行了分选，然后利用transwell与TAMs共培养。结果表明，敲低TAMs中LTBR减弱了对G-MDSC的募集，但是对M-MDSC的募集没有影响（图3J，图S6G，H）。另一方面，激活TAMs中LTBR则促进对G-MDSC的招募（图S6I）。此外，TAMs和CD8+T细胞的共培养试验表明，敲低TAMs中LTBR促进了CD8⁺T细胞的增殖（图3K，图S6J）。据报道，TAMs可通过激活CD8⁺T细胞的抑制性受体，如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（TIM-3），诱导CD8⁺T细胞耗竭和失能，降低CD8+T细胞存活率和肿瘤杀伤活性。我们的TAMs和CD8⁺T细胞共培养试验表明，TAMs中LTBR的激活促进了PD1和TIM-3的表达，同时抑制了CD8⁺T细胞中IFNγ和GZMB的释放（图S6K）。而敲低TAMs中LTBR则挽救了CD8⁺T细胞功能（图S6L）。上述功能研究表明，LTBR⁺TAMs通过招募G-MDSC、抑制CD8⁺T细胞增殖以及破坏其肿瘤杀伤活性而促进肿瘤进展。总之，上述结果表明LTBR+TAMs介导CD8⁺T细胞免疫抑制和G-MDSC的募集。

图3. LTBR有助于促进TAMs的免疫抑制活性和M2表型

（A和B）用对照siRNA（Ctrl）和LTBR的siRNA（siLTBR）处理TAMs后的RNA测序数据，进行趋化因子和趋化因子受体生物合成（A）和T细胞耗竭（B）的基因集富集分析（GSEA）。热图显示了Ctrl和siLTBR组之间差异表达的基因（p<0.05，倍数变化>1.5）。（C）通过ELISA分析上述TAMs上清中趋化因子和细胞因子的浓度。（D）在TAMs中转染siLTBR或Ctrl后，通过蛋白质印迹实验检测ARG2、COX2、TGFβR1和CSF2RB的蛋白表达水平（n=3）。β-actin作为实验对照。（E）比较（D）中的相对蛋白水平（n=3）。（F和G）通过FACS测量了经Ctrl和siLTBR处理的TAMs中PDL1（F）和MR（G）的平均荧光强度（MFI）（n=3）。（H和I）激动性LTBR抗体（LTBR-Ag）激活TAMs中的LTBR后，通过qRT-PCR检测参与趋化因子和趋化因子受体生物合成（H）和T细胞耗竭（I）相关基因的表达（n=3）。（J） 利用transwell进行TAMs和G-MDSC的共培养，并通过显微镜观察G-MDSC的迁移（n=3）。（K）用siLTBR或Ctrl转染的TAMs与CFSE标记的同种异体T细胞共培养72小时。通过FACS测定T细胞的增殖（n=3）。数据显示为平均值±标准误差；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；采用配对学生t检验。

LTBR通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号维持TAMs的免疫抑制特性

鉴于LTBR信号可激活经典的和非经典的NF-κB信号通路，我们假设NF-κB信号通路可能是一种潜在的下游机制。GSEA结果显示，敲除TAMs中LTBR影响非经典的NF-κB信号通路，而不是经典的NF-κB信号通路（图4A，图S7A）。值得注意的是，敲低TAMs中LTBR同时也破坏了Wnt/β-catenin信号通路（图4B）。非经典NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号分别通过RELB和β-catenin参与癌症进展。事实上，敲低TAMs中LTBR减少了RELB和β-catenin向细胞核的移位（图4C，D）。相反，LTBR激活则促进TAMs中RELB和β-catenin向细胞核移位（图S7B）。此外，Cistrome数据库的ChIP-seq数据(http://cistrome.org/)结果表明，RELB可结合到CXCL1、CXCL2、PDL1、COX2、IL10和TGFβ基因的启动子上，而β-catenin可结合到PDL1、ARG2、COX2，TGFβR1、IL10、MR和TGFβ基因的启动子上，同时伴随着H3K4me3的高结合峰（图4E、F、图S7C）。随后，ChIP实验进一步证实了上述ChIP-seq结果（图4G，H）。此外，RELB的敲低可阻碍LTBR激活对下游CXCL1、CXCL2、PDL1、COX2、IL10和TGFβ的上调作用。β-catenin的敲低可减弱LTBR激活对PDL1、ARG2、COX2、TGFβR1、IL10、MR和TGFβ的上调（图4I、图S7D、E）。

此外，我们进一步探究了TAMs中调控LTBR表达的潜在上游信号通路。ChIP-seq分析表明，β-catenin也可结合在LTBR的启动子区域，伴随着H3K4me3的高度结合（图S7F）。与我们的研究结果相一致，TAMs中Wnt3a激活的Wnt/β-catenin信号通路上调了LTBR的表达，而敲低β-catenin则显著抑制LTBR表达（图4J，图S7G）。最后，ChIP实验进一步证实β-catenin可以结合在LTBR的启动子区域（图4K）。由于LTBR激活促进了Wnt/β-catenin信号通路（图4B、C、图S7B），上述结果表明，在TAMs中Wnt/β-catenin信号通路和LTBR表达之间存在反馈调节通路。

接下来，我们评估了LTBR是否可以通过非经典的NF-κB信号或Wnt/β-catenin信号协助TAMs招募G-MDSC。首先，我们利用transwell将TAMs与G-MDSC共培养。结果表明，敲低TAMs中RELB的减弱了LTBR激活对G-MDSC的募集，而敲低β-catenin后则无显著变化（图4L）。此外，TAMs和CD8⁺T细胞的共培养试验表明，敲低RELB或β-catenin可以在LTBR激活后挽救CD8⁺T细胞增殖（图4M）。总之，这些结果表明，LTBR通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号维持TAMs的免疫抑制活性。

图4. LTBR通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号维持TAMs的免疫抑制和M2表型

（A和B）利用对照siRNA（Ctrl）和LTBR的siRNA（siLTBR）处理的TAMs的RNA测序数据，进行非经典的NF-κB信号通路（A）和Wnt/β-catenin信号通路（B）的基因集富集分析（GSEA）。（C和D）在TAMs中转染siLTBR或Ctrl后，通过蛋白质印迹检测RELB和β-catenin的蛋白质水平，然后进行定量比较（n=3）。（E和F）利用Cistrome项目的ChIP-seq数据分析RELB、β-catenin和H3K4me3在T细胞耗竭（E）和趋化因子（F）相关基因启动子上的潜在结合。（G和H）通过ChIP实验分析RELB（G）和β-catenin（H）与特定基因启动子的结合（n=3）。（I）在激动性LTBR抗体激活LTBR后，用RELB的siRNA（siRELB）、β-catenin的siRNA（siβ-cat）或对照siRNA（Ctrl）转染TAMs。转染后24小时，通过qRT-PCR测定目标基因的表达（n=3）。（J） 通过qRT-PCR检测用Wnt-3a或DMSO处理的TAMs中LTBR的表达（n=3）。（K） 通过ChIP实验分析β-catenin与LTBR基因启动子的结合（n=3）。（L）将（I）中的TAMs在transwell中与G-MDSC共培养。通过显微镜分析G-MDSC的迁移（n=3）。（M）TAMs按（I）处理，然后与CD8⁺T细胞共培养。通过流式细胞术分析CD8⁺T细胞的增殖（n=3）。数据显示为平均值±标准误差*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；通过配对学生t检验（D、G、H、J和K）或单因素方差分析结合Tukey多重比较检验（I、L和M）。

敲除TAMs中的LTBR通过破坏TAMs的免疫抑制活性和M2表型抑制肿瘤生长

为了评估LTBR⁺TAMs体内功能，我们构建了巨噬细胞特异性LTBR敲除（LTBR^cKO）小鼠。在确认LTBR敲除效率后，向LTBR^cKO小鼠和对照（Ctrl）小鼠气管内滴注Lewis肺癌（LLC）细胞，以建立原位肺癌模型（图5A，图S8A，B）。LLC滴注三周后，生物发光成像显示，与对照组小鼠相比，LTBR^cKO小鼠的肿瘤生长受到抑制（图5B，C）。此外，与对照组小鼠相比，LTBR^cKO小鼠的肿瘤重量显著降低（图5D，E）。FACS分析证实，与对照组小鼠相比，LTBR^cKO小鼠TAMs中LTBR的表达受到显著抑制（图5F）。进一步的分析表明，敲除TAMs中的LTBR抑制了CXCL1、CXCL2、ARG2、PD-L1、MR、COX2、TGFβR1、CSF2RB、IL-10和TGF-β的表达，表明巨噬细胞特异剔除LTBR的破坏了TAMs的免疫抑制特征和M2表型（图5G-I、图S8A）。此外，TIM分析显示，与对照组小鼠相比，LTBR^cKO小鼠呈现出更多的CD8⁺T细胞浸润，以及更少的M2样TAMs和G-MDSC浸润，表明敲除TAMs中LTBR可以重塑TIM（图5J，K）。同时，在TAMs中敲除LTBR可以延长荷瘤小鼠的存活时间（图5L）。利用皮下黑色素瘤和胶质瘤小鼠模型得到同样的结果（图S8C-H）。

图5. 敲除TAMs中的LTBR通过破坏TAMs的免疫抑制活性和M2表型抑制肿瘤生长

（A）给巨噬细胞特异性LTBR敲除（LTBR^cKO）小鼠和对照（Ctrl）小鼠气管内滴注携带荧光素酶的Lewis肺癌（LLC）细胞建立原位肺癌模型。（B）LLC接种后三周（A），通过体内成像系统监测原位肺癌的生长（n＝6）。（C）对（B）中每组荷瘤小鼠的平均荧光信号进行量化比较。（D）为（B）中代表性肺癌大体图像。（E）测量并比较来自（D）的肿瘤重量（n=6）。（F-H）通过FACS检测从（D）TAMs中LTBR（F）、MR（G）和PDL1（H）的平均荧光强度（MFI）（n=6）。（I）在来自（D）的分选的TAMs中，通过qRT-PCR检测目标基因的表达水平（n=3）。（J和K）通过流式细胞术测量T细胞、髓系来源的抑制性细胞（MDSC）和M2样TAMs的浸润（n=6）。（L）通过log-rank检验比较携带LLC的LTBR^cKO和Ctrl小鼠的存活曲线，**表明p<0.01。数据显示为平均值±标准误差*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001，使用配对学生t检验（C、E-I和K）。

靶向TAMs递送LTBR的siRNA通过破坏TAMs的免疫抑制能力进而改善免疫治疗疗效

接下来，我们想回答是否靶向TAMs抑制LTBR会影响肿瘤生长和免疫治疗反应。由于MR在TAMs中特异性表达（图S9A），我们使用了一种对MR具有高亲和力的靶向TAMs递送siRNA的载体系统（V）（图S9B）。建立肺癌原位模型后静脉注射Cy5-标记的siLTBR（Cy5-siLTBR）和载体负载的Cy5-标记siLTBR（V&Cy5-siLTBR）。体内活体成像显示，V&Cy5-siLTBR主要在肿瘤组织中富集，而在其他组织中无富集（图6A）。免疫荧光结果进一步表明，该系统可以将siLTBR特异性地递送到TAMs中（图6B）。随后，利用原位肺癌模型，LLC滴注一周后，每三天静脉各注射一次V&siCtrl、siLTBR和V&siLTBR。五次治疗后，采用相比siLTBR或V&siCtrl治疗组，V&siLTBR治疗组的小鼠的肿瘤重量显著下降（图6C，D）。此外，FACS分析表明，与递送siLTBR组相比，V&siLTBR治疗组具有更强的抑制TAMs中LTBR表达的能力（图6E，F）。分选治疗后的TAMs，我们发现靶向TAMs递送LTBR的siRNA可显著抑制CXCL1、CXCL2以及参与T细胞耗竭和免疫抑制的基因表达，如：PDL1、IL10和TGFβ（图6G、图S9C）。进一步的TIM分析表明，与仅使用siLTBR或V&siCtrl治疗组相比，V&siLTBR治疗组增加了CD8⁺T细胞的浸润，减少了M2样TAMs和G-MDSC的浸润（图6H，图S9D-F）。小鼠血清ELISA分析进一步表明，与V&siCtrl治疗组相比，V&siLTBR治疗组降低了CXCL1、CXCL2、IL10和TGFβ释放，增加了IL12和IFNγ释放（图6I）。与仅用siLTBR或V&siCtrl治疗的小鼠相比，用V&siLTBR治疗的小鼠存活时间更长（图6J）。上述结果表明，靶向TAMs递送siLTBR可破坏TAMs的免疫抑制能力，并通过增加CD8⁺T细胞生存以及减少M2样TAMs和G-MDSC重塑肿瘤微环境，进而抑制肿瘤生长。

由于LTBR⁺TAMs参与免疫治疗抵抗，为进一步判定靶向TAMs抑制LTBR是否会影响ICIs的治疗效果，我们首先建立了原位肺癌模型，然后静脉注射生理盐水、V&siLTBR、PDL1单克隆抗体（aPDL1）和V&siLTBR联合aPDL1（图S10A）。经过五次治疗后，V&siLTBR联合aPD-L1治疗的小鼠的肿瘤重量明显低于仅V&siLTBR或aPD-L1处理的小鼠，表明靶向TAMs递送siLTBR可增强PDL1抗体的治疗效果（图6K，L）。此外，在分选的TAMs中，我们发现V&siLTBR联合aPDL1治疗组中CXCL1、CXCL2、PDL1、ARG2、COX2、TGFβR1、CSF2RB、MR、IL10和TGFβ基因的表达水平明显低于仅aPDL1治疗组（图6M）。与仅采用V&siLTBR或aPD-L1治疗组相比，V&siLTBR联合aPDL1处理组表现出较高的CD8⁺T细胞浸润，以及较低的M2样TAMs和G-MDSC浸润（图6N，O，图S10B，C）。最后，V&siLTBR联合aPDL1治疗的小鼠比仅采用V&siLTBR或aPDL1处理的小鼠具有更长的生存期（图6P）。上述结果表明，抑制TAMs中的LTBR可以通过破坏TAMs的免疫抑制活性进而提高ICIs对肺癌的治疗疗效。

图6. 靶向TAMs递送LTBR的siRNA破坏了TAMs免疫抑制能力，并改善免疫治疗疗效

（A） 尾静脉注射Cy5-siLTBR和Vector（V）&Cy5-siLTBR6小时后，通过IVIS-Lumina系统观察Cy5-siLTBR在荷瘤小鼠不同器官中的分布。（B）用FITC-F4/80抗体和Hoechst对（A）中荷瘤小鼠肿瘤切片进行染色，共聚焦显微镜采集图像。（C和D）通过气管内滴注Lewis肺癌（LLC）细胞建立肺癌原位模型。LLC滴注一周后，每三天静脉各注射一次V&siCtrl、siLTBR、V&siLTBR，共五次。最后一次注射三天后，收集肿瘤（n=6）。（C）和（D）中显示了代表性图像和肿瘤重量的定量比较。（E和F）FACS分析并比较来自（C） 中TAMs的LTBR的平均荧光强度（MFI）（n=6）。（H）FACS检测T细胞、MDSC和M2样TAMs的浸润情况。（G）对经（C）处理的小鼠TAMs进行分类。通过qRT-PCR检测分选的TAMs中目标基因的表达（n=3）。（I）收集经（C）处理的荷瘤小鼠的血清，通过ELISA测定目标细胞因子的浓度（n=3）。（J）在V&siCtrl、siLTBR或V&siLTBR治疗后，分析荷瘤小鼠的存活曲线。采用log-rank检验，与V&siCtrl比较 :**，p<0.01；***，p<0.001；与siLTBR比较: #，p<0.05。（K）原位肺癌癌症模型建立后，每3天用生理盐水、V&siLTBR、PDL1抗体（aPDL1）、V&siLTBR联合aPDL1治疗荷瘤小鼠，共5次。之后，对肿瘤进行解剖和拍照。（L）比较（K）中不同治疗方法小鼠的肿瘤重量（n=6）。（M）在来自（K）的分选TAMs中，通过qRT-PCR检测与趋化性、T细胞耗竭和免疫抑制相关的基因的表达（n=3）。（N和O）在（K）不同的处理后，通过FACS测量MDSC（N）和T细胞（O）的比例（N=6）。（P） 观察不同药物治疗后荷瘤小鼠的存活曲线，采用log-rank检验，如（K）所示；与生理盐水相比：**，p<0.01；***，p<0.001；与V&siLTBR相比:###，p<0.001；与aPDL1相比:@@@，p<0.001。（Q）示意图显示，通过iMOS筛选出LTBR可作为肿瘤免疫治疗中TAMs新的免疫检查点，LTBR通过非经典的NF-κB信号和Wnt/β-catenin信号耗竭CD8⁺T细胞并招募G-MDSC促进肺癌生长。数据显示为平均值±标准误差；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****、p<0.0001；通过配对学生t检验（I和M）或Tukey多重比较检验（D、F、G、L、N和O）。

讨  论

尽管基于ICI的免疫治疗已在一些肿瘤中有效应用，但为包括LUAD在内的大多数癌症患者鉴定和选择合适的免疫检查点进行治疗仍然是一个巨大的挑战。最近，多组学和scRNA-seq技术为寻找更多的肿瘤生物标志物和靶点提供了平台。然而，对LUAD的几项多组学研究仅关注包括EGFR、KRAS和ALK在内的肿瘤驱动基因的突变、重排和表观遗传修饰，对TIM关注较少。此外，scRNA-seq方法为TIM带来了独特的视角，整合分析多组学和scRNA-seq数据是具有潜力的分析策略。在这项研究中，我们开发了一种独特的免疫检查点筛选平台iMOS，并成功筛选出LTBR作为TAMs上的新型免疫检查点（图1）。近期黑色素瘤scRNA-seq分析数据显示LTBR主要在髓系细胞上表达。这与我们在LUAD中发现LTBR在髓系细胞中表达，尤其是在TAMs中高表达相一致（图1）。此外，LTBR⁺TAMs的浸润与LUAD分期、免疫治疗失败和预后不良有关（图2）。更重要的是，TAMs中抑制LTBR会阻止肿瘤生长，甚至通过逆转TAMs介导的免疫抑制来增强免疫治疗的疗效，如，增强CD8⁺T细胞浸润、抑制G-MDSC和M2样TAMs浸润（图5）。这些结果表明，iMOS可能是一种发现更多替代免疫检查点分子的重要策略，并可以应用于其他肿瘤。

据我们所知，LTBR在LUAD进展中的作用，特别是在TAMs中的作用尚未被报道。在这项研究中，我们发现LTBR⁺TAMs的浸润与LUAD分期和预后不良有关。重要的是，免疫治疗无应答者的LTBR⁺TAMs数量也高于应答者，表明LTBR⁺TAMs可能参与了LUAD免疫治疗耐药（图2）。之前的研究报道，LTBR参与巨噬细胞的分化和功能。在淋巴结和脾脏中，CD169⁺巨噬细胞的分化依赖于LTBR信号通路。考虑到LTBR的配体LTα1β2主要表达在T、B和NK细胞等淋巴细胞上（图S4B），我们推测LTα1β2和LTBR的相互作用可能介导LUAD中淋巴细胞和巨噬细胞之间的通讯。在一项炎症研究中，Wimmer等人发现T细胞来源的LTα1β2通过与LTBR结合抑制巨噬细胞的促炎活性，提示激活LTBR可以作为负反馈信号，增强巨噬细胞介导的T细胞免疫抑制。在本研究中，我们首先证明LTBR激活可以通过上调免疫抑制分子，包括PDL1、ARG2、COX2、IL10和TGFβ，增强TAMs介导的CD8⁺T细胞的免疫抑制（图3H、I、图S6E）。值得注意的是，TAMs表达的PDL1可以直接诱导CD8⁺T细胞的耗竭。ARG2表达的TAMs与T细胞竞争精氨酸，从而破坏CD8⁺T细胞代谢并抑制其增殖。此外，COX2通过产生前列腺素E2（PGE2）增强TAMs介导的T细胞耗竭。据报道，TAMs分泌的IL10和TGFβ可以直接抑制CD8⁺T细胞的细胞毒性。上述证据进一步支持LTBR激活的TAMs可通过上调这些免疫抑制分子诱导CD8⁺T细胞耗竭。但是，LTBR对TAMs功能的调控仍需要在其他肿瘤模型中进一步验证。

越来越多的证据表明，非经典的NF-κB信号通路参与肿瘤的发生、发展和转移。同时，非经典的NF-κB信号通路的激活预示着较差的生存期和对肿瘤治疗的抵抗。然而，非经典的NF-κB信号通路在TAMs中的作用目前还知之甚少。本文中，我们发现非经典的NF-κB信号通路的关键转录因子RELB可以结合趋化因子（CXCL1和CXCL2）、T细胞耗竭相关基因（PDL1和COX2）和M2表型基因（IL10和TGFβ）的启动子区域。敲除TAMs中RELB可以减弱LTBR激活后上述基因的表达。意料之外的是，我们还发现抑制LTBR可以下调TAMs中的Wnt/β-catenin信号通路（图4）。之前的研究，包括我们的研究，表明活化的Wnt/β-catenin信号通路促进巨噬细胞M2表型并发挥促肿瘤活性。本文中，我们发现敲除TAMs中β-catenin可部分逆转LTBR激活后T细胞耗竭相关基因（PDL1、ARG2、TGFβR1和COX2）和M2表型基因（MR、IL10和TGFβ）的上调（图4I），提示LTBR活化可能部分通过Wnt/β-caten蛋白信号通路增强TAMs的免疫抑制活性和M2表型。然而，LTBR激活是否直接或间接影响Wnt/β-catenin信号通路需要在未来进一步研究。

有趣的是，我们还发现Wnt信号通路可通过β-catenin与LTBR启动子结合来调节LTBR的表达（图4J，K）。Wnt/β-catenin信号在肺癌的发生和进展中起着重要作用。同时，Wnt/β-catenin信号通路也介导了肿瘤细胞与TAMs之间的串扰。最近的证据表明，Wnt/β-catenin信号通路活化可抵抗抗肿瘤免疫反应，导致免疫治疗耐受。然而，由于Wnt信号在组织发育和稳态中的重要作用，Wnt信号的抑制剂使用会带来全身性副作用，包括神经并发症、肾损伤和肠道毒性。因而，在未来的研究中需要开发靶向干预Wnt信号通路的策略。而在我们的工作中，靶向干预TAMs可能是一种策略。

尽管ICIs已被应用于肿瘤治疗，但由于肿瘤微环境存在大量的髓系免疫抑制细胞，尤其是TAMs，一些患者在ICIs治疗后出现明显的耐药性。几种靶向TAMs的药物，如抗CSF1R抗体、CCR2抑制剂、抗CD40激动剂和CD47/SIRPα阻断剂，由于其在阻断巨噬细胞存活和募集、消除免疫抑制和增强吞噬作用方面的作用，已被用于临床试验，但仍存在一些缺点。如，CSF-1R的阻断会促进单核细胞来源的巨噬细胞的增多，导致肿瘤复发。由于正常红细胞上高表达CD47，阻断CD47/SIRPα轴可能导致致命的自身免疫性溶血性贫血。基于此，迫切需要开发更精确、更特异的TAMs靶向策略用于癌症免疫治疗。在这项研究中，我们使用iMOS发现LTBR可作为TAMs的一种新免疫检查点。值得注意的是，LTBR⁺TAMs的浸润与LUAD分期和预后不良有关。此外，在接受ICIs治疗的LUAD患者中，治疗无效者的LTBR表达以及LTBR⁺TAMs浸润远高于治疗有效者。在ICIs治疗过程中，与LTBR表达较低的患者相比，LTBR表达较高的患者的预后更差（图2）。这些结果表明，LTBR不仅可以作为TAMs的免疫检查点，还可以作为预测免疫治疗反应和临床预后的潜在生物标志物。更重要的是，靶向TAMs递送LTBR siRNA可通过增强CD8⁺T细胞活性和抑制G-MDSC募集逆转TAMs介导的免疫抑制进而提高ICI的疗效（图6）。我们的研究还同时提出了一种针对LTBR⁺TAMs的联合ICIs潜在的肿瘤免疫治疗策略。

结  论

本研究建立了免疫检查点筛选平台iMOS，发现LTBR可作为新型TAMs免疫检查点；机制研究揭示，LTBR通过非经典的NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路维持TAMs免疫抑制活性和M2表型；临床前研究表明，LTBR⁺TAMs的浸润与LUAD分期、免疫治疗耐药性和预后不良有关，靶向LTBR⁺TAMs可能是改善肿瘤免疫治疗的一种有前景的策略。

方  法

人体研究

LUAD组织芯片购自武汉Servicebio（中国武汉）。TD-FOREKOW 2期多中心随机对照试验中的临床LUAD石蜡包埋组织（ClinicalTrials.gov:NCT04338620）从空军军医大学唐都医院胸外科获得。该研究已获得空军军医大学唐都医院伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。所有相关患者均已获得知情同意。表S1总结了患者的临床数据。

动物研究

C57BL/6小鼠在特定的无病原体（SPF）设施中饲养。动物被饲养在22±2℃、55±10%的湿度、12/12小时的光/暗循环中，可以自由获取正常的食物和水。为获得巨噬细胞特异性Cas9表达的小鼠，将Rosa26-floxed STOP-Cas9敲除小鼠（库存号026175，Jackson Laboratories）与LyzM-Cre小鼠（库存编号019096，Jackson Laboratory）饲养在一起。为建立巨噬细胞特异性敲除LTBR小鼠，我们将巨噬细胞特异性Cas9表达的小鼠通过静脉注射携带LTBR sgRNA的慢病毒（每只小鼠1×108个病毒颗粒）。使用注射了携带空载体的慢病毒的巨噬细胞特异性Cas9转基因小鼠作为对照。实验开始时，动物体重为24±2g。所有动物实验均经空军军医大学动物实验管理委员会批准，并按照美国国立卫生研究院出版的《美国科学院实验动物护理和使用指南》进行，以确保动物的伦理和人道关怀。

Lewis肺癌（LLC）细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，Manassas，VA）。对于原位癌症模型，如文献所述进行1×10⁶ LLC的气管内滴注和定量。通过使用IVIS成像系统（Xenogen，Perkin-Elmer）测量癌症生长。对于皮下黑色素瘤小鼠模型，在C57BL/6小鼠的背部皮下注射2×10⁶个B16细胞。通过滑动卡尺测量长（L）和短（S）肿瘤直径来监测肿瘤体积（肿瘤大小=0.513×L×S²）。在指定时间通过腹腔注射戊巴比妥钠（60mg/kg）对小鼠实施安乐死，然后测量肿瘤重量。

为了在体内消耗巨噬细胞，每4天静脉注射每20克体重1毫克氯屈膦酸盐或对照脂质体，共5次，并使用流式细胞术验证清除效率。

真核细胞研究

如文献所述，获得并培养骨髓源性巨噬细胞（BMDM）、RAW264.7细胞和体外培养的TAMs。简而言之，用DMEM（Gibco，Waltham，MA）冲洗小鼠股骨和胫骨，并用红细胞裂解缓冲液（Beyotime，中国上海）裂解红细胞。计数后，每15cm非组织培养板在DMEM中接种2000万个骨髓（BM）细胞，DMEM中含有10%FBS（Gibco）、2 mmol/L L-谷氨酰胺（Gibco）、25 ng/mL小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，SinoBio，中国北京）和100 U/mL青霉素/链霉素（Kibco）。分化3天后，用室温DMEM洗掉非贴壁细胞，然后再培养3天，以获得均匀的BMDM群体，如FACS所示。

为了获得体外培养的TAMs，我们首先用胰蛋白酶-EDTA溶液（Beyotime）收获LLC，用细胞培养基（DMEM补充了10%FBS和100 U/ml青霉素/链霉素）洗涤一次，然后将其重新悬浮在BMDM培养基中。然后，我们在BMDM培养基中以1:1的比例（1×10⁵ BMDM:1×10⁵ LLC每6孔板在2 ml培养基中）共培养BMDM和LLC 3天。随后，移除培养皿中的细胞培养基，并通过使用500ml胰蛋白酶-EDTA溶液（Beyotime）分离剩余的癌症细胞3分钟，然后将其从培养皿中丢弃。随后，我们清洗了六个孔中的巨噬细胞三次，并补充了巨噬细胞培养基。与LLC共培养后，获得TAMs进行进一步研究，包括FACS、qRT-PCR、蛋白质印迹等。

MDSC、M-MDSC（CD11b⁺Ly6C^hiLy6G^-）和G-MDSC（CD11b⁺Ly6C^lowLy6G⁺）如先前报道的那样获得。简而言之，用GM-CSF（25ng/ml）和IL-6（25ng/ml，SinoBio，中国北京）诱导BM细胞4天，以获得经FACS证实的MDSC。通过FACS AriaIII流式细胞仪（BD免疫细胞仪系统）从MDSC中分选出M-MDSC（CD11b⁺Ly6C^hiLy6G）和G-MDSC（CD11b⁺Ly6C^lowLy6G⁺），然后接种在透孔室中进行进一步的迁移分析。

RNA提取和qRT-PCR分析

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Waltham，MA）从细胞中提取总RNA。使用HiScriptII Q RT SuperMix试剂盒（Vazyme，中国南京）获得cDNA文库。qRT-PCR检测使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix Kit（Vazyme）进行，使用ABI PRISM 7500实时PCR系统（Life Technologies，Waltham，MA），β-actin用作内部对照。qRT-PCR引物见补充方法。

蛋白质印迹

使用含有蛋白酶抑制剂混合物（Beyotime，中国上海）的RIPA缓冲液收获全细胞裂解物。然后，根据制造商的说明，分别使用提取试剂盒（Beyotime）提取核酸和细胞质蛋白质。用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，Waltham，MA）测定蛋白质浓度。样品通过SDS-PAGE分离，并在聚偏二氟乙烯膜上印迹。用5%脱脂乳溶液封闭膜1小时，然后用补充方法中列出的一抗和二抗进行检测。蛋白质印迹使用ChemScope仪器（Clinx Science Instruments Co.，有限公司，中国上海）。

免疫荧光

抗原回收后，用5%BSA封闭小鼠和临床标本的固定肿瘤组织。将切片与不同的抗体一起孵育，并用Hoechst 33342染色。使用激光扫描共聚焦显微镜（FV-1000，Olympus，日本东京）拍摄切片。用于免疫荧光的抗体列于补充方法中。

迁移分析

将TAMs接种到12孔板中，并用siLTBR或对照（Ctrl）转染。同时，将2×10⁴ M-MDSC（CD11b⁺Ly6C^hiLy6G^-）或G-MDSC（CD11b⁺Ly6C^lowLy6G⁺）悬浮在200μL无血清DMEM中，并接种在上部转运室中。在37°C下孵育12小时后，用棉签擦掉未侵入的细胞。然后，用结晶紫（Beyotime）标记穿透transwell室的细胞，并用显微镜计数。

T细胞增殖

用70mm尼龙膜研磨和过滤小鼠的脾脏和淋巴结，以获得单细胞悬浮液。红细胞裂解后，用FACS AriaIII流式细胞仪（BD免疫细胞仪系统）分选CD8⁺T细胞（7AAD^-CD3⁺CD4^-CD8⁺）。分选的CD8⁺T细胞（5×10⁴）用CFSE（5 nM）标记，并在包被CD3和CD28抗体（Biolegend）的96孔板中培养，以激活这些T细胞。然后，用siLTBR或对照转染的TAMs（1×10⁵细胞）与活化的CD8⁺T细胞共培养3天。通过FACS检测T细胞增殖，对CFSE荧光强度的降低进行评估。

流式细胞仪

细胞用补充方法中列出的不同抗体染色。使用FACS CantoPlus或FACS AriaIII流式细胞仪（BD Immunocytometry Systems，NJ，USA）按照常规方案进行荧光激活细胞分选仪（FACS）分析。使用FlowJo vX.0.6软件（FlowJo，LLC，Ashland，OR）对数据进行分析。7-AAD染色排除死细胞。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

根据供应商的方案，使用ELISA试剂盒（Invitrogen，Waltham，MA）测量不同处理下血清中CXCL1、CXCL2、IL-12、TGFβ、IL-10和IFNγ的含量。ELISA试剂盒已列入补充材料。

TCGA数据分析

LUAD多组学数据集（包括体细胞突变、拷贝数、DNA甲基化、转录表达谱）和相关临床信息从TCGA数据门户下载(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)（2018年12月）。通过应用ESTIMATE算法计算免疫评分和基质评分下载的数据集。采用非配对学生t检验或Tukey多重比较检验的单因素方差分析对不同LUAD组织中LTBR、LTα、LTβ和LIGHT的表达进行分析和测试。TCGA泛癌临床数据资源的总生存期（OS）用于调查LUAD患者的临床结果。生存曲线采用Kaplan-Meier法进行检验，统计显著性采用时序（Mantel-Cox）检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。LUAD表达数据的四个独立数据集（GSE8894，GSE13213，邮编43767，以及GSE68465)以及从Gene Expression Omnibus下载其相关临床信息（表S1）以进行进一步验证。

SNV分析

使用GSCA进行SNV分析网站(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/)。简言之，SNV百分比通过：突变样品数量/癌症样品数量计算。SNV瀑布图由maftools生成。R包存活率用于估计突变和未突变基因之间的存活差异。还进行了对数秩检验，p值<0.05被认为具有显著性。

CNV分析

使用GSCA进行CNV分析网站(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/)。简而言之，mRNA表达和CNV数据通过TCGA条形码合并。根据Person的相关系数测试配对mRNA表达与CNV之间的关联，并通过FDR调整p值。通过时序检验对CNV变化的生存分析进行了检验。

甲基化分析

使用MethSurv网站对LUAD中指示的基因甲基化进行生存分析(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)。

差异表达基因（DEGs）分析

使用R包limma筛选出高和低免疫评分之间的DEG（倍数变化>1.5，p<0.05）。使用基因簇V3.0进行聚类。使用ComplexHeatmap软件包绘制热图。

泛癌生存分析

使用TISIDB网站对指示基因进行全癌生存分析(http://cis.hku.hk/TISIDB)。

基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析

使用Metascape网站对指定基因进行GO和KEGG分析(http://metascape.org)。

单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据处理和分析

使用Cell Ranger Single-Cell软件套件针对GRCh38人类参考基因组处理来自GEO数据库（GSE131907）的肺癌癌症scRNA-seq数据和正常肺scRNA-sek数据（GSE134355）。Cell Ranger生成的处理数据用于进一步分析。然后，根据三个指标对细胞进行质量控制，包括总UMI计数、检测到的基因数量和每个细胞线粒体基因计数的比例。随后，过滤出UMI计数低于2000和500个基因或线粒体基因计数高于10%的细胞。为了清除潜在的双重体，还筛选出了UMI计数超过40000个、检测到5000个基因的细胞。之后，我们应用了库大小校正方法，在Scanpy中使用normalize_total函数对原始数据进行归一化。然后，将对数归一化计数数据用于下游分析。

使用Scanpy对标准化的scRNA-seq数据进行降维和无监督聚类处理。首先，利用参数为“n_top_genes=2000”的scanpy.pp.highly_variable_gene函数选择2000个高变基因进行下游分析。其次，利用scanpy.pp.回归函数回归出每个细胞的总计数、线粒体基因计数百分比和热激蛋白相关基因计数百分比的影响。最后，利用具有100个分量的主成分分析矩阵来揭示变化的主轴，并利用参数为“svd_solver=arpack”，n_comps=100的scanpy.tl.pca函数对数据进行去噪

为了可视化结果，通过使用默认参数在scanpy.tl.UMAP函数中实现的统一流形近似和投影（UMAP）来降低处理后的scRNA-seq数据的维度。为了对单个细胞进行聚类，我们使用了一种名为Leiden的无监督图聚类算法。通过使用具有默认参数的scanpy.tl.rank_genes_groups函数来鉴定簇特异性标记基因。

空间转录组学分析

癌症的空间转录组学数据从CROST数据库下载(https://ngdc.cncb.ac.cn/crost/home)，空间转录组学综合库对原始数据进行质量控制，以去除低质量的读数。利用剪接转录比对将测序读数与参考基因组进行比对之后，将细胞的转录组位置与空间坐标进行匹配。如前所述，进行了降维、聚类、空间变量基因分析、细胞类型注释分析、空间相关性和共定位分析。

RNA测序

按照制造商的说明，用TRIzol试剂（Invitrogen，Waltham，MA）提取经siCtrl和siLTBR处理的TAMs的总RNA。使用Dynabeads Oligo（dT）25-61005（ThermoFisher，Waltham，MA）从1mg总RNA中纯化Poly（A）RNA。之后，在94℃下5-7分钟，使用镁RNA片段化模块（NEB，Ipswich，MA）将聚（A）RNA片段化成小块。随后，用SuperScript™II逆转录酶（Invitrogen，cat.1896649，USA）逆转录切割的RNA片段以合成cDNA，然后用大肠杆菌DNA聚合酶I（NEB，Ipswich，MA）、RNase H（NEB、Ipswich、MA）和dUTP溶液（ThermoFisher，Waltham，MA）合成U标记的第二链DNA。在热不稳定的UDG酶（NEB、Ipswich、MA）处理U标记的第二链DNA后，通过以下条件用PCR扩增连接产物：在95℃下初始变性3分钟；在98℃下变性15秒，在60℃下退火15秒，并在72℃下延伸30秒，共8个循环；然后在72℃下最终延伸5分钟。最后，我们在illumina Novaseq™6000（LC-Bio Technology CO.，有限公司，杭州，中国）上进行了2×150bp的双端测序（PE150）。

RNA-seq数据的生物信息学分析

Fastp软件用于删除包含适配器污染、低质量碱基和默认参数未确定碱基的读取。我们使用HISAT2将读数映射到小家鼠GRCm39的参考基因组。每个样本的映射读数都是使用默认参数的StringTie组装的。然后，将所有样本中的所有转录组合并，使用gffcompare软件包重建一个全面的转录组。在生成最终转录组后，StringTie和用于估计所有转录本的表达水平。StringTie用于通过计算FPKM（FPKM=[总外显子标记/映射标记（百万）×外显子长度（kB）]）来检测mRNA的表达水平。通过R package edgeR对FC>2或FC<0.5的差异表达基因进行筛选，并用参数F检验比较嵌套线性模型（p<0.05）(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).

基因集富集分析（GSEA）

使用GSEA软件53（版本4.3.2）结合分子特征数据库（版本7.4）进行GSEA分析。

免疫细胞浸润分析

使用TIMER2.0网站分析LUAD中免疫细胞浸润与LTBR表达水平之间的相关性。

染色质免疫沉淀（ChIP）

使用Cistrome数据库对H3K4me3、RELB和β-catenin进行芯片测序分析 (http://cistrome.org)。ChIP实验如前所述进行。

靶向TAMs核酸药物递送系统

依据我们以往的研究，制备了阳离子魔芋多糖（cKGM）和PEG-His修饰的海藻酸盐（PHA）。LTBR siRNA及其对照购自RiboBio Biotech（中国广州）。通过将5mg/ml的siRNA溶液与5mg/ml的cKGM溶液以1:3的比例混合形成cKGM和LTBR siRNA复合物。将cKGM和siRNA复合物溶液和5mg/ml PHA盐水溶液以1:1的比例混合，形成三重复合物（载体和siRNA）。免疫荧光染色用于确定cKGM和siRNA复合物的内吞作用，并如前所述测试了核酸药物的生物分布。从注射肺癌细胞后第7天起，每3天静脉给荷瘤小鼠注射2μg siRNA/g体重的Vector&siRNA。之后分离肿瘤组织进行进一步分析。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行分析。对各组之间的比较进行了非配对学生t检验、配对t检验或多重比较检验的单因素方差分析。生存曲线采用Kaplan-Meier法进行检验，统计显著性采用Mantel-Cox检验。Pearson相关系数和p值用Hmisc R软件包中的rcorr函数计算。p值<0.05被认为具有统计学意义（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！