In Cell Western (ICW)是一种在微孔板内进行的免疫荧光测定方法，基于LiCor近红外荧光检测技术，具有高信噪比、可重复、高通量的特点。那么如何建立ICW实验体系呢？我们可以参考下图流程来一步步建立体系，今天将为大家介绍前面四个步骤，一起来看看吧！
定义实验体系
在实验之前，我们首先需要考虑几个重要的问题：通过ICW实验，想检测的目标是什么？有哪些抗体可以检测该目标？检测靶点是在细胞表面还是在细胞内？应该使用哪种细胞系？需要设置哪些对照？以及想使用哪种成像仪进行检测？
基于不同的实验项目，对上述问题的回答都是不同的。在ICW实验体系建立过程中，对于通用的重复及对照的设置，此处能给出一些参考。
技术重复
ICW是基于多孔板的测定，技术重复和生物重复可以在单个孔板中进行。
变异系数会随着孔尺寸和工作体积的减小而增大。对96孔板，建议进行4-6次技术重复；而对于384孔板，建议至少进行4-8次技术重复。此外，对于每个样品，至少进行3次生物重复。
根据重复，进行数据统计，如计算标准偏差 (SD) 、标准误 (SEM) 等，测量重复之间的变化，评估样本之间的差异。
对照设置
下面列出了ICW 的一些典型对照：
1.空白对照孔：仅含有 PBS 缓冲液，用于减轻边缘效应的潜在影响。
2.二抗背景对照孔：包含二抗，没有一抗或均一化试剂。
3.阳性对照孔：含有一抗和二抗，可采用过表达样品等作为阳性样品。
4.阴性对照孔：含有一抗和二抗，可采用敲除样品等作为阴性样品。
选择均一化方法
ICW实验中，均一化使用内部对照，对孔之间细胞数量的微小差异进行数学校正，以将不同孔之间细胞数量差异对目标信号的影响降至最低。下面，将介绍两种适用于ICW实验的均一化方法。
细胞染色方法
ICW可以使用细胞染色方法进行均一化。细胞染色剂是一种与细胞广泛结合的试剂，其检测信号能很好地代表孔中细胞的数量。
下表列出了一些LI-COR成像系统支持的细胞染色剂：
图1 LI-COR成像系统支持的部分细胞染色剂
当然，要选择正确的染色剂，还需要思考一些其他问题，例如：染色剂的激发和发射光谱？染色剂是否与固定和渗透方法相容？染色剂可渗透细胞吗？染色剂检测范围是否符合实验设计？
翻译后修饰均一化方法
翻译后修饰均一化(post-translational modification, PTM) 通过使靶蛋白的特异性修饰相对于所有靶蛋白均一化，来监测蛋白质翻译后修饰的变化，此时靶蛋白作为其自身的内部对照。
PTM 均一化的使用需要来源于不同宿主的两种一抗：
1.修饰特异性抗体：针对目标蛋白特定修饰的抗体。
2.泛特异性抗体：能识别所有带修饰及无修饰目标蛋白的抗体。
在使用PTM 均一化方法时，需要考虑进行抗体验证，排除两种一抗表位干扰的问题。
确定接种细胞数
在ICW体系的建立过程中，十分重要的一步是需要选择合适的接种细胞数，确保检测到的目标蛋白信号和均一化参考信号都在其线性范围内。
Empiria Studio®软件中预设的孔板分析模板里提供了细胞染色线性分析模板，可帮助您分析或设计实验，以确定要在分析中接种的细胞数量。
图2 Empiria Studio®中提供的预设细胞染色线性模板
实验数据经Empiria Studio®软件分析可得出细胞数和检测信号值间的数学关系，绿色部分区域具有良好线性，可根据该线性分析结果确定合适的接种细胞数。
图3 Empiria Studio®软件中“查找线性范围” 分析示例
验证抗体
一抗和二抗的选择和验证对于获得可靠的 ICW 结果至关重要。
以下测定常用于评估针对特定抗原的抗体反应：酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术、蛋白免疫印迹。
在选择抗体之前，我们先来了解一下抗体的两种特性——选择性和特异性。选择性指在存在其他抗原的情况下抗体优先结合靶抗原的能力；特异性指抗体识别目标抗原的能力。抗体验证最好使用多种方法交叉验证，确认抗体的选择性和特异性。ICW为细胞原位检测，如果仅用免疫肽进行 ELISA 测定是不够的，并不能保证与内源性蛋白的反应。
当然，一种抗体可能只在少数技术中得到验证，但这并不意味着它不适合其他应用，因此还可以进行抗体应用适用性的验证。例如，一种推荐用于IF的抗体也可能适用于细胞内免疫试验。
小结一下，建立一个ICW实验体系，需要仔细考虑检测样本和实验设计相关因素，选择合适的均一化方法校正孔间差异，并在实验中使用能检测到良好线性信号的接种细胞数，同时验证抗体在该实验体系中的适用性。
在下一期我们将介绍ICW体系建立流程的后半部分，敬请期待！
关于In Cell Western的更多信息，可以参考LI-COR应用手册：In Cell Western Assay Development Handbook，点击下方链接即可下载。
精彩待续，敬请期待！
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