近红外 Western Blot Troubleshooting
Western Blot(WB)是分子生物学中蛋白研究的经典方法，被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白表达或者修饰情况。美国LI-COR公司，利用近红外荧光检测的专利技术，开发出 Odyssey 系列成像系统，具有双色直接检测，无需添加酶底物；定量准确；线性范围宽；灵敏度高等几大优点。
上一篇我们已经了解了近红外WB实验一些常见问题的优化方法，在这一篇里，让我们继续了解更多实验相关问题的优化方法吧。
信号微弱或者没有信号
原因：抗体不足
一抗结合目的蛋白的能力弱，提高一抗使用量，优化最适浓度，或换其他供应商一抗尝试。
延长一抗孵育时间（室温下 4-8 小时或者4℃过夜），不要重复使用抗体。
原因：抗体降解
一抗和二抗会因保存条件不当，或保存时间过长失去结合能力。
建议检查抗体效期，若过期，更换新鲜的抗体原液；避免重复使用抗体。
原因：使用的去垢剂浓度过高
稀释抗体时，建议添加终浓度为0.1-0.2%的Tween 20。
对于PVDF膜，二抗孵育时，推荐添加终浓度为0.01 -0.02% SDS，一些抗体需要浓度更低的SDS。
对于NC膜，请勿在任何步骤中添加SDS。
原因：封闭液影响
Figure1: 927-60001 Intercept® Blocking Buffer
为了提高灵敏度和封闭效率，建议使用Odyssey 封闭液。
原因：抗原上样量不合适
Figure 2: Serial dilution of target Protein
加样时，太多或太少的蛋白样本，都会降低抗体灵敏性。当蛋白样本太少时，可能导致抗原不足；当蛋白样本太多时，可能导致非特异性结合。建议先进行目的蛋白上样量梯度测试，确认最佳上样浓度。
原因：蛋白没有从蛋白胶中转移出来
检查转膜液，检查转膜过程的各个步骤是否正确 。
湿转是蛋白转膜的金标准，需验证在当前转膜条件下，蛋白能够转到膜上。转膜液中甲醇的量、膜的类型、电压和转膜时间等因素，都会影响蛋白的转移效率。
Figure 3: BG-blotMINI迷你垂直转印仪
用 Odyssey 预染 Marker 指示转膜情况。也可以用 REVERT™ Total Protein Stain试剂，在转膜完成后对膜进行染色，观察转膜效率。另外也可对胶进行考马斯亮蓝染色，以确定是否有蛋白留在胶中。
Figure 4: Chameleon® NIR Prestained Protein Ladders
Figure 5: REVERT™ Total Protein Stain
原因：蛋白没有转到膜上
转膜后先让膜自然风干，再去封闭。这样能使蛋白结合得更为牢固。对于 PVDF 膜，用甲醇重新激活膜，并在封闭前用水冲洗。
转移液含有SDS会降低转移蛋白与膜的结合力，特别是低分子量的蛋白。建议尝试降低或者去除 SDS（注意：对某些蛋白来说，溶液中不超过 0.5%的 SDS可以提高其转移效率）。
大蛋白（>140 kDa）转移需要较低浓度的甲醇（10%），并且可能要将SDS浓度加至0.05%。小蛋白在转移过程中可能会穿过膜，因此需要使用更高浓度的甲醇（30-40%）和更低的电压转移。
原因：膜封闭过度
建议室温下封闭时间不要超过1小时。
出现非特异性或者非目标条带
原因：抗体浓度过高
Figure 6: Serial dilution of secondary antibody
按照推荐浓度，稀释抗体。
缩短二抗孵育时间，建议室温孵育1小时。
使用封闭液稀释抗体。
稀释抗体时，添加终浓度为0.1-0.2%的Tween 20。
原因：双色实验中抗体间的交叉反应
进行双色反应之前，建议先在两张的膜上分开观察两个通道的WB结果，从而了解哪些是目的条带以及目的条带所在的位置。
确认一抗和二抗的来源和种属。避免同时使用大鼠和小鼠一抗。因为这两个种属的亲缘关系很近，在某些情况下，抗大鼠二抗会和小鼠的 IgG 发生反应，抗小鼠二抗也会和大鼠的 IgG 发生反应。
两个二抗应该来自相同的宿主物种（例如，山羊抗小鼠和山羊抗兔），以消除二抗的相互反应。
为了降低出现交叉反应的概率，可适当减少二抗用量。按照LI-COR IRDye 二抗包装袋中的小卡片推荐的浓度范围，稀释二抗。建议1：20,000 稀释，进行尝试。
使用高交联吸附处理过的二抗，LI-COR IRDye Secondary Antibodies。
原因：使用的封闭液不合适
Figure 8: Effects of blocking buffer on detection of PKCα.
没有一种封闭液适合所有的实验体系。根据使用的一抗，优化选择最适合的 Blocking 试剂。
原因：溴酚蓝条带
常用的Loading buffer的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在700通道会有信号从而影响蛋白信号。可以使用LI-COR 4x Protein Sample Loading Buffer，指示剂为Orange G，在700通道无信号影响。
Figure 10: LI-COR 4x Protein Loading Buffer
精彩待续，敬请期待！
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