In Cell Western (ICW)是一种在微孔板内进行的免疫荧光测定方法，基于LiCor近红外荧光检测技术，具有高信噪比、可重复、高通量的特点。在上篇的介绍中，我们已经了解了ICW体系建立流程中的前半部分。今天，我们将一起来了解后面四个步骤，确定固定透化条件、选择封闭液并确定一抗浓度，同时合理使用统计学方法来评估实验体系的可行性。
接上篇
确定固定和透化条件
固定和渗透能够保护细胞结构，并使得抗体通过细胞膜和核膜进入细胞。
图4 常见的几种固定和透化试剂
在实验项目中需尝试摸索出有效的固定条件，可更换固定剂种类和浓度进行测试。当最佳固定条件未知时，可使用3.7%的甲醛溶液作为固定剂。
当然，若检测的目标为细胞表面的蛋白，那么可以不进行细胞透化处理，直接进入下一步骤。
选择封闭液
ICW检测中，固定和透化细胞后，接着添加封闭液到孔中，结合细胞中潜在的非特异性结合位点。通过封闭，最大限度地减少了后续一抗、二抗和非目的蛋白的非特异性结合。
实验中，可选择多种封闭液进行评估，确定最合该ICW体系的最佳封闭液。如果实验中需要多种抗体，需要综合选择针对各个抗体都有效的封闭条件。
图5 LI-COR封闭液，可配合LI-COR Odyssey成像系统使用以获得更佳成像效果
确定一抗浓度
可通过抗体滴定实验，根据阳性对照、阴性对照、最小背景之间的最大倍比变化，来确定抗体浓度。
参考抗体说明书给出的稀释度选取滴定浓度范围，包括建议稀释度两倍以上和两倍以下区域，进行抗体滴定实验。其中二抗使用遵循二抗说明书上的稀释建议。
Empiria Studio®软件中提供了抗体滴定模板，可帮助您进行抗体滴定实验设计和分析。
图6 Empiria Studio®中提供的抗体滴定模板，不同颜色背景代表不同稀释度抗体
通过Z'因子测定评估实验体系
在我们确定以上实验条件的过程中，如何去评估当前的实验条件是否可靠呢？可以考虑进行Z'因子测定(Z'-factor assay)来评估当前体系的质量。
Z'因子是高通量筛选中常用的一个统计参，反映了阴性/阳性对照样本数据之间的变异和信号检测动态范围。Z'因子分析可以在建立ICW体系的任一过程中进行，设计Z'因子实验时，可测定多个检测板，在同一检测板上需要同时设置背景扣除孔、阴性对照和阳性对照样品的重复孔。
图7 Empiria Studio®中提供的Z'因子测定模板
在验证过程中，通过计算阳性对照和阴性对照的均值和标准差，来输出Z'因子值。
Z'因子的方程式定义如下：
其中：
通过以上公式可以看到，Z'因子评估了阴性和阳性两个极端样本的可重复性和信号变化，并且通过计算阳性对照与阴性对照均值间的差异来定义了信号检测的动态范围。在 0.5≤Z'<1 的情况下，测定系统中样品信号与背景的分离程度良好，且数据变异程度低，这表明该检测质量较好；当0<Z'<0.5，表示样品信号和背景之间存在边际差异，数据变异性较高，这表明该检测质量较差；而当Z'≤0时，检测数据不可靠。根据Z'因子检测结果，可以帮助我们判断当前的实验体系是否可用，是否存在优化空间。
图8 In Cell Western体系建立流程，图中列出了上文介绍的关键步骤，体系建立过程中可选择进行Z'因子测定
回过头来总结一下，我们在ICW实验体系建立过程需要注意的几个最关键步骤就是上图所示的几点了。当然，要建立一个可靠的实验体系，大家也别忘了合理运用统计分析来帮助条件优化哦。
关于In Cell Western的更多信息，可以参考LI-COR应用手册：In Cell Western Assay Development Handbook，点击下方链接即可下载。
精彩待续，敬请期待！
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