近红外 Western Blot Troubleshooting
Western Blot(WB)是分子生物学中蛋白研究的经典方法，被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白表达或者修饰情况。美国LI-COR公司，利用近红外荧光检测的专利技术，开发出 Odyssey 成像系统，具有双色直接检测，无需添加酶底物；定量准确；线性范围宽；灵敏度高等几大优点。
如何优化近红外WB实验呢？我们一起来看看不同类型的问题和优化方法。
均匀分布的高背景信号
原因：膜被污染
Figure 1: Coomassie contaminated container
在实验前，用甲醇清洁器皿，托盘等。处理膜的过程中，始终使用干净的镊子。
原因：封闭条件的影响
BSA封闭液可能会导致近红外WB膜的高背景信号和非特异性抗体结合，建议不要使用BSA封闭。
脱脂奶粉中含有IgG，会与抗山羊的二抗产生交叉反应，且脱脂奶粉中含有内源性生物素或磷酸表位，可能造成高背景信号。
不同的一抗用不同的Blocking试剂稀释，会有不同的反应。根据使用的一抗，优化选择最适合的Blocking试剂。
推荐使用LI-COR Intercept Blocking Buffer，其经过优化，能为WB和其他免疫应用提供低背景，高稳定性的性能。
Figure 2: Effects of blocking buffer on detection of PKCα
Figure 3: 927-60001 Intercept Blocking Buffer
原因：缺少去垢剂
在一抗孵育，二抗孵育和洗涤过程中添加终浓度为0.1%-0.2% 的Tween 20。
若使用PVDF膜，二抗孵育时，添加终浓度0.01%-0.02%的SDS。
封闭时，勿添加去垢剂。
原因：洗膜不充分
建议抗体孵育完成洗膜时，洗4次，每次洗5分钟。如果膜背景很高，增加洗膜次数和Buffer体积。确保Buffer中含有0.1%-0.2%Tween 20。过量的Tween 20 (0.5%-1%) 可能会降低信号。
原因：二抗浓度过高
使用LI-COR二抗时，建议二抗浓度不可过高，第一次实验可尝试1 : 20000 稀释。若二抗稀释浓度高于1 : 5000，可能会引起高背景信号。
Figure 4: Effect of secondary antibody dilution on image data
Figure 5: LI-COR Secondary Antibody recommended Dilution
原因：抗体孵育体积不足
增加抗体用量，保证整个膜的表面都能被抗体覆盖。孵育抗体时，将膜置于摇床上轻轻晃动。
Figure 6: Incubate Blot covered enough antibody with gentle shaking
原因：PVDF膜自身高背景
使用低荧光背景膜，转膜前确认膜背景均匀，LI-COR推荐Immobilon-PVDF Kits。
Figure 7: 926-32098 PBS Blocking Buffer and PVDF Kits
背景不均匀，有斑点
原因：在小体积试剂中封闭多张膜
如果要在一个容器中封闭多张膜，需要加足够的Blocking试剂使得所有的膜可自由晃动且充分接触试剂。
原因：部分干燥的膜，或未完全湿润的膜
如果使用PVDF膜，要用100%甲醇湿润和活化，直到其变成半透明的灰色。然后，将膜放置于PBS或TBS中，润湿5分钟或直到颜色均匀。由于PVDF膜疏水强，甲醇活化有助于PBS或TBS与膜相互作用。
如果使用NC膜，在封闭前，将膜在PBS或TBS中润湿5分钟或直到颜色均匀。
封闭完成后，后续操作过程中，都要保持膜完全湿润。
原因：膜被污染
仪器可以扫描出残留在膜上的指纹，因此切勿用手触摸膜，建议始终使用干净的镊子取膜。如镊子浸入抗体溶液（尤其是染料标记的二抗）后，要求使用甲醇清洁镊子。否则，脏的镊子会将染料留在膜上，无法洗掉。
勿用中性笔在膜上做标记，但可使用Odyssey Pen或者铅笔，不会在通道产生信号。
Figure 8: FingerPrint (Left) ; BluePen (Right)
Figure 9: Odyssey Pen
原因：未清洁成像系统
如果使用DLx/CLx系统，成像前用纯净水擦拭清洁玻璃表面。
如果使用XF/FC系统，避免使用用于考染胶成像的托盘，成像前用酒精擦拭清洁托盘。
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