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PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量，用于后续的研究和检测。
rtPCR的流程：RNA提取--反转录（RNA-cDNA）--PCR（变性-退火-延伸，需考虑PCR引物设计、PCR酶、PCR反应体系及程序设置）--PCR产物检测（主要是RNA的表达）。
通常需要结合扩增曲线，溶解曲线，标准曲线来进行综合分析。 1. 扩增曲线应呈现出平滑的S型曲线，起始无扩增，起峰时间正常，能达到平台期。由扩增曲线得到的Ct值是判断实验成功与否的重要参考，一般建议，阳性结果（科研）调整到15-30之间，阴性对照Ct>35， 内参基因一般小于20，且样品间内参的Ct值差不超过1，表明内参基因表达量稳定，复孔Ct值标准偏差不超过0.5。 2.溶解曲线应呈现单峰，峰的宽度较小，表明是特异性扩增。3. 标准曲线的斜率范围-3.58~-3.10，对应引物的扩增效率90%~110%，R2代表线性拟合度，一般大于0.98。 RNA纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。 3) 用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。 由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。 2) 在超净台中，换用移液器分别加入引物，避免交叉污染。 应体系污染、试剂失效；耗材与仪器不匹配，检测通道不正确；仪器长时间未做矫正。加样误差；标准品降解；模板浓度高或有抑制物；引物或探针不 佳；PCR酶灵敏度不高及活力下降。1) 标准品加样体积大于2微升、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选择硅化枪头，使用文库稀释液稀释标准品，降低耗材管壁对DNA吸附。2) 避免反复冻融、电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品。5) 更换灵敏度更高，线性关系更好的试剂，校正-20℃冰箱，使用时将酶置于冰上。
1）一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集信号， Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。3）对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。4）对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。- 每个样品至少要做3个平行孔，以防在 后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好融解后放 在4℃；配置体系时在冰上操作；减少加样误差，每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样；所有成分加完后，离心去除气泡。
