各种成像技术可以通过使用显微镜等设备观察和记录生物样本的微观结构和功能。在动物实验中，显微成像技术被广泛应用于研究细胞、组织和器官的结构与功能，以及生物过程的动态变化。目前，已经发展了许多类别的成像技术，不知道大家是不是已经看花眼了呢？
本期实验菌将对目前常用的显微成像技术做一个系统的集合，看看大家都了解哪些仪器？万一能用到也可问问指南针~
（1）光学显微镜（光学显微镜和荧光显微镜）：光学显微镜是最常见的显微成像工具，可以观察到生物样本的细胞、组织和器官结构。荧光显微镜则通过激发样本中的荧光标记物，可观察到特定分子、细胞和组织的活动和定位。
其中，荧光显微镜在细胞培养和组织染色切片中是最常用的手段之一。
图1 左为MC3T3-E1细胞骨架染色，右为NIH3T3活死染色
（2）生物扫描电子显微镜：生物扫描电镜主要利用二次电子成像拍摄材料的表面三维形貌情况，拍摄照片为黑白照片；利用电子束代替光束，具有更高的分辨率，可观察到更细微的结构。一般用来观察细胞外表面的变形以及受损情况等，也可以观察材料在细胞表面的分布情况，广泛应用于检测生物样品、非均相有机材料、无机材料等微米、纳米范围内的表面特征。
图2 左和中是真菌的菌丝和分生孢子图
右是材料表面大肠杆菌的附着图
（3）生物透射电子显微镜：生物透射电子显微镜通过将电子束传输（透射）到样本中，并收集通过样本的电子，然后通过对电子的散射和透射进行检测和成像。TEM需要非常薄的样品制备，通常使用特殊的切片技术将生物样本制成纳米级厚度的切片。这些样品通常经过特殊的染色或冻结处理，以增强对细胞和组织的对比度。生物透射电子显微镜能够提供高分辨率的图像，可以观察到细胞器、细胞内膜系统、细胞核、蛋白质复合物、病原体等生物样本的细节。它还可以用于观察细胞超微结构、细胞分裂过程、细胞内运输、细胞凋亡等细胞生物学和病理学研究。
图3 左面和中间图为纳米材料进入细胞切片局部和放大图；
右为材料附着细胞表面的细胞切片图
图4 金黄色葡萄球菌在低于药物MIC作用后细胞壁发生溶解
图5 斑马鱼组织
当然，生物透射电子显微镜也有一些限制。首先，样品制备过程对于保持细胞和组织的天然状态至关重要，因为制备过程可能导致伪影和伪结构的形成。其次，由于电子束对样品的辐射损伤，观察需要在真空环境下进行，这限制了对活体和湿样品的直接观察。
（4）激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）：一种高分辨率的显微镜技术，用于观察生物样本的细胞结构和分子分布。CLSM结合了激光聚焦和点扫描技术，通过使用激光光源和特殊的光学装置，可以在样本的不同深度上获取具有高对比度和分辨率的图像。
CLSM的优势在于其高分辨率和对比度，使得观察细胞和组织的内部结构变得更加清晰。此外，由于只有焦平面上的荧光被检测到，CLSM还能够消除样品深度的散射和模糊效应，提供更精确的三维图像。CLSM广泛应用于细胞生物学、神经科学、生物医学研究等领域。它可用于观察细胞器、分子的局部化和相互作用、细胞内运输、细胞信号传导等生物过程。此外，CLSM还可以进行多重荧光标记，以同时观察不同分子或细胞组分的定位和相互作用。
图6 细胞成像：拍摄放大倍数和效果样图
（5）生物冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）：基于超低温冷冻制样寄传输技术，可以直接观察液体、半液体样品；生物样品常规制样方法中干燥过程可能对含水量较高的样品产生影响，而冷冻技术能避免细胞变形，具有制样简单快速的优点；另外与同样可以观察含水样品的环境扫描电镜相比，冷冻扫描可在高真空状态下观察，提高了分辨率，并且可以对样品进行断裂，但成本和技术要求相对较高。
图7 真菌菌丝
（6）冷冻透射电镜（Cryo-TEM）：基于超低温冷冻制样寄传输技术，将样品冷却到液氮温度（77K），用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品；通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌
图8 SBA复合蛋白管冷冻透射电镜结果展示
（7）负染色技术：一种制备电子显微镜样品图像呈现复反差的技术。用于观察样品中的颗粒性物质或生物大分子。用金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色方法称为负染技术。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。
图9 负染色制样后观察到细胞培养提取的外泌体
（8）小动物活体光学成像系统：该技术通过采用生物发光与荧光探针标记研究对象，借助灵敏的光学检测仪器，直接在活体动物水平监测疾病的发展变化并开展相关药物的临床前研发。该技术已被越来越广泛地应用于临床前疾病研究的各个领域，包括癌症研究、心血管疾病研究、神经疾病研究、炎症疾病研究、免疫学及干细胞研究等。具有功能全面、灵敏度高、成像效果清晰、定量准确等性能优势，能够实现在活体水平上直接监测疾病发展过程及开展药物研发的需求。
图10 活体成像效果展示
（9）微计算机断层扫描技术（Micro-CT）：又称微型CT、显微CT，是一种非破坏性的3D成像技术，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。它与普通临床的CT最大的差别在于分辨率极高，可以达到微米（μm）级别， Micro-CT可用于医学、药学、生物、考古、材料、电子、地质学等领域的研究。
图11 大鼠膝关节显微CT成像结果展示
（10）磁共振成像（MRI）： 磁共振成像依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，即可得知构成这一物体原子核的位置和种类，据此可以绘制成物体内部的结构图像。
图12 MRI图像展示
（11）光声成像（PAI）：近年来发展起来的一种非入侵式和非电离式的新型生物医学成像方法。当脉冲激光照射到生物组织中时，组织的光吸收域将产生超声信号，这种由光激发产生的超声信号称为光声信号。生物组织产生的光声信号携带了组织的光吸收特征信息，通过探测光声信号能重建出组织中的光吸收分布图像。光声成像结合了纯光学组织成像中高选择特性和纯超声组织成像中深穿透特性的优点，可得到高分辨率和高对比度的组织图像，从原理上避开了光散射的影响，突破了高分辨率光学成像深度“软极限”（~1 mm），可实现50 mm的深层活体内组织成像。
图13 动物活体光声成像结果展示
以上所介绍的11种成像方式均可以实现对细胞、组织的显微观察从而判定相关材料的生物反应。这些显微成像技术为研究人员提供了一种观察动物体内微观结构和生物过程的工具，有助于深入理解生物学机制和疾病发展过程。
尽管成像技术检测在生物实验中具有许多优势，但也需要考虑到其局限性和适用范围。不同的成像技术有不同的分辨率、深度、对比度和样本处理要求。因此，在选择和应用成像技术时，需要综合考虑研究问题、样本特性和实验条件等因素，以确保获得准确和可靠的成像结果。
