WB 技术颇具挑战性，尤其是磷酸化蛋白的 WB 检测，更是困难重重！这是因为细胞裂解后，蛋白酶和磷酸酶会被释放出来，它们可能会降解或修饰蛋白质，进而对检测结果产生影响。那么，我们该如何应对呢？
首先看下磷酸化蛋白的作用都有哪些？
1、细胞信号传导研究：检测激酶活性和磷酸化蛋白的变化，研究细胞内信号通路的激活或抑制。
2、疾病机制研究：例如，在癌症研究中，磷酸化蛋白的异常变化可能与肿瘤发生、发展和转移相关。
3、药物研发：检测药物处理后磷酸化蛋白的变化，评估药物的作用靶点和效果。
4、发育生物学：研究胚胎发育过程中磷酸化蛋白的调控，了解细胞分化和器官形成的机制。
5、应激响应：观察细胞在应激条件下（如氧化应激、缺氧等）磷酸化蛋白的变化，研究应激适应机制。
在 Western blot 实验中检测磷酸化蛋白时，需要注意以下几点：
1. 样本处理：
在细胞裂解过程中，蛋白酶和磷酸酶会被释放出来，可能会影响检测结果。为了防止蛋白降解或修饰，可以将样本置于冰上，并使用预冷的缓冲液。同时，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂也是非常必要的。
2.样本上量
磷酸化蛋白的丰度通常较低，大概只有总蛋白量的10%，甚至更低，这可能会导致在 Western blot 实验中检测到的信号较弱。为了获得清晰的磷酸化条带，增加每个孔上的蛋白量是一个常见的策略。
3. 检测总蛋白含量
为确定 WB 上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。
4. 抗体选择：
选择针对磷酸化蛋白的特异性抗体，并确保其质量和适用性。抗体的稀释倍数也需要适当调整，以确保最佳的检测效果。
5. 封闭剂选择：
避免使用牛奶作为封闭剂，因为牛奶中含有大量的磷酸化酪蛋白，可能会影响磷酸化抗体对靶蛋白的结合。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。
6.检测条件优化：
根据实验需求和蛋白特性，选择合适的底物进行化学发光检测，并优化孵育时间和检测条件，以获得最佳的检测结果。
7. 结果分析：
在分析 Western blot 结果时，需要注意特异性和非特异性条带的识别。磷酸化蛋白 Western blot 实验中常常会出现非特异性的条带，需要通过与对照组的比较来进行分析和判断。
8. 内参的问题
磷酸化蛋白检测需要设置两个内参，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，比如你要检测Akt磷酸化，那你就要同时跑一个Akt的蛋白和Akt磷酸化的抗体，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了；另一个是普通内参比如actin和GAPDH等。普通内参是作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响。
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