电镜测试各类送样方式及注意事项

文摘 2024-05-29 16:45 山东

一、生物透射

1. 细胞类

10的6次方以上的细胞，用细胞刮刀刮下来（不要反复刮取，动作迅速一次性刮取下来），1500-3000转离心，5-10min，收集细胞于管底肉眼可见2-3粒大米体积大小的样品，如果细胞量很多，把细胞团块用细针尖挑成几个小团块，弃上清，沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液，然后放入4°C冰箱保存。

2. 真菌类

方法一（固体培养基培养，观察微生物的菌丝/分生孢子）

原位固定法，将培养基切成大小为1cm，厚度为0.2cm的方块，直接用2.5%的戊二醛进行固定，固体培养的标本取样时尽可能把培养基削薄一点，块切小；

方法二（液体培养基培养）

①酵母：收集好的菌体在0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液（其中含0.1-0.5mol/L半胱氨酸）中浸洗15-30min，然后用6%戊二醛固定，至于4℃放置2h以上。

②真菌孢子：15%甲醛（0.1M,pH7.4的磷酸缓冲液配置）中处理2h，缓冲液漂洗后，用6%戊二醛（0.1M,pH7.4的磷酸缓冲液配置）固定，至于4℃放置过夜。或者用4%戊二醛（含0.01mol/LCaCl2·2H2O和3%TritonX100，用0.1M，pH7.4磷酸缓冲液）固定2-4h，用缓冲液漂洗后，再用上述固定液（不含Triton和CaCl2）固定过夜；

3. 细菌类

吸取OD0.5-0.8的培养物，离心后弃培养基，收集菌体沉淀于管底黄豆大小，至少需要小米粒大小，可以用PBS洗1-2次，弃掉上清液，沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液，然后放入4°C冰箱保存。

注意：对于细胞壁比较厚的细菌可以用3%戊二醛（含0.01%CaCl2·2H2O，用0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液）固定，4℃放置过夜；

4. 组织类

新鲜取材，取材位置准确，组织大小尽量在1-3mm³，离体取材后请立即投入4℃预冷的2.5%的戊二醛固定液中，然后放入4°C冰箱保存，可固定2-3h后再取出取材到合适打大小（对于无法下沉的样品，如植物组织，一定要通过抽真空，让样品沉下去）

二、生物扫描

1. 细胞类

①贴壁细胞：细胞需要接种在爬片上，爬片直径在1cm以内，正面朝上，切勿将有细胞一面放反，置于孔板底部，沿容器壁缓慢加入4℃预冷的2.5%戊二醛固定液，然后放入4°C冰箱保存过夜。

②悬浮细胞：1500-3000转离心，5-10min，离心收集细胞于管底，肉眼可见黄豆体积大小，弃上清，沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液，然后放入4°C冰箱保存过夜。（务必收集到足量的样品，样品量太少后续处理会有样品损失，样品量太多会影响固定效果）

2. 动物组织类

新鲜、快速取材，取材位置准确，尽量在低温4℃操作，组织大小尽量在1-3mm³，离体取材后请立即投入4℃预冷的2.5%戊二醛固定液中，然后放入4°C冰箱保存过夜，如离体取材后不方便立即切小，也可固定2-3h后再取出组织切到合适打大小。对于皮肤、血管等有观察面要求的样本需要将观察面朝上固定于支持物或者观察面朝上放置于管内（管状组织需要新鲜时切面剖开内面朝外固定于支持物）。

3. 植物类

取一小块植物组织浸入4℃预冷的3%戊二醛培养皿（或硬纸卡）上，随后用锋利刀片切成 0.5mm×0.5mm×3mm 小长条薄片。植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，因此，需要适当的抽气使材料沉入固定液中，从而达到充分固定的目的。

抽取气体：将植物组织同固定液一起倒入注射器，用乳胶手套食指堵住注射器出口，右手拉动针栓，将注射器口垂直向上，松开食指，右手轻推针栓使液面上的气泡从注射器口排出，反复多次，直至组织沉入固定液。转入1.5ml离心管，使体积到1-1.3ml。

4. 细菌类样本（液体培养基培养）

吸取OD值0.5-0.8的培养物，离心后弃培养基，收集菌体沉淀于管底黄豆大小，至少需要绿豆大小，可以用PBS洗1-2次，弃掉上清液，沿管壁缓慢加入4℃预冷的2.5%戊二醛固定液，然后放入4°C冰箱保存。

注意：对于细胞壁比较厚的细菌可以用3%戊二醛（含0.01%CaCl2·2H2O，用0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液）固定，4℃放置过夜；

5. 真菌类

①固体培养基培养，需要观察微生物的菌丝/分生孢子：采用原位固定法，将培养基切成大小1cm以内，厚度为0.2cm的方块，直接放入2.5%的戊二醛进行固定，固体培养的标本取样时尽可能把培养基削薄一点，块切小；

②液体培养基培养：

酵母：收集好的菌体在0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液（其中含0.1-0.5mol/L半胱氨酸）中浸洗15-30min，然后用6%戊二醛固定，至于4℃放置2h以上。

真菌孢子：15%甲醛（0.1M,pH7.4的磷酸缓冲液配置）中处理2h，缓冲液漂洗后，用6%戊二醛（0.1M,pH7.4的磷酸缓冲液配置）固定，至于4℃放置过夜。或者用4%戊二醛（含0.01mol/LCaCl2·2H2O和3%TritonX100，用0.1M，pH7.4磷酸缓冲液）固定2-4h，用缓冲液漂洗后，再用上述固定液（不含Triton和CaCl2）固定过夜。

三、负染色电镜

1.可接收样品类型：蛋白、纤维素、脂类、外泌体、细菌等，其他类型样品请咨询工作人员。

①液体样品提供100-200μl，提供合适的浓度（上机前直接滴加样品，不做稀释或浓缩）；

②粉末样品20mg左右，并告知配置比例；

③外泌体样品50μL，干冰运输寄送（不少于15kg干冰）；

④病毒要灭活后寄送，4℃运输寄送；

⑤细菌样品，4℃运输寄送。

四、冷冻透射电镜

1.不限于生物样品，可测电子束敏感材料样品，但高分辨图像出图相对困难。

2. 样品一般是水溶液样品，体积200微升，要求浓度比常温测试大100-1000倍。

3. 有机溶剂的含量不超5%，水溶外的其他溶剂请联系负责老师。

4. 不测挥发有毒有磁性放射性样品。

5. 粉末要求5-10mg，分散剂默认是水，粉末粒度不超1um。

6. 薄膜或块状样品不能直接拍摄，需另行制样（如离子减薄、包埋切片、FIB等）

五、冷冻扫描电镜

1. 可以提供新鲜样品低温寄送，如果担心寄送过程样品变化，可以用2.5%戊二醛固定后寄送。

2. 根据样品的保存条件，常温保存可直接寄送；

3. 4℃保存可以加2-3个冰袋寄送，冰袋一定不要直接接触样品管，用泡沫包裹样品，避免样品结冰，注意冰袋融化不要弄湿预约单；

4. 如果是-20度保存样品需要干冰寄送，干冰消耗量以每天7kg/d计算，保证足够量的干冰；

5. 样品管上编号需要按照送样单上的编号，尽量简化编号。

六、激光共聚焦显微镜

1. 菌液/污泥/污水类样品

① 样品量：5000 rpm离心10 min，可得到绿豆大小沉淀，参考图（1.5 mL离心管）大小的菌体沉淀

②细菌类需要死活染色/ROS染色的，一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触。

③蛋白/多糖类染色，一般加冰袋泡沫盒4度保存或者2.5%的戊二醛固定4度保存，样品不和冰袋接触。

④污泥类样品可以进行冰切或者刀切，冰切收费50/样。

2. 生物膜样品

①样品量：金属/瓷砖/岩石等块体类建议长宽高尺寸不超过1 cm，薄膜类直径尺寸不超过2 cm；且均要求样品表面平整，需要标出拍摄面。

②一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触

③若在爬片上培养生物膜，可将爬片粘于培养皿底部，充满培养基，封口膜密封完全，再4度保存。

3. 植物类

①植物类样品可进行简单冰切及刀切，软化等特殊类请走病理组织切片测试项目

②一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触

③做过的植物类样品淀粉、胡萝卜，土豆、叶片、根、茎，拟南芥等。

4. 需要与细胞共培养的样品

①块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等

送样量：

（1）与细胞的作用方式为直接接触的话，至少1个/种细胞/时间点；

（2）样本处理方式为浸提的话，可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提，根据浸提方式按量和检测时间点提供；

制样要求：若是需要把细胞接种到材料上的话，金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为10-15 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为15 mm。

②液体类

送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；若采用稀释后样本测试，则须告知稀释倍数及工作液浓度；若溶剂为有机溶剂（如DMSO，醇类，酚类等），最高工作液浓度中，溶剂的占比低于0.5%；。

③粉末类

送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；

（1）可溶性粉末：注明溶剂的种类（如无水乙醇，异丙醇，DMSO，培养基，PBS或者生盐水等），当样品对溶剂有特殊需求时，请在送样时附加所需溶剂；

（2）不可溶粉末：注明样本性质，灭菌方式，及分散为均匀悬浮液所需必要步骤

5. 需要提供清楚激发/发射波长，拍摄类型2D/3D，拍摄倍数等要求，

6. 染色剂，标明染料名称和拍摄条件（激发/发射波长，），指南针常见染色剂及收费见已有染料见激光共聚焦仪器详情常见问题2：https://www.shiyanjia.com/buffet-details-485.html；若需要特殊染料，本公司可代购或自行提供（需要附带染色使用说明书）

7. 细胞类样品直接拍摄，需要封片后常温避光邮寄。

8. 固体类直接拍摄样品建议长宽不超过20mm，厚度不超过10mm，重量不超过10g，一定标出测试面。

9. 微米材料直接拍摄类建议进行云视频沟通，且微粒尺寸不低于5微米。

七、病理组织切片

常规包埋块大小规格1cm*1cm、2cm*2cm；包埋块厚度一般为0.5-0.7 cm；石蜡切片的厚度范围3-60 μm。

1. 动物组织-各类脏器

a.组织需要被固定液固定24小时以上；如要做免疫组化等指标，固定时间最好不超过2个月；

b.寄送过程送样容器要能够完全容纳组织，组织不能蜷缩，固定液要完全淹没组织；

c.漂浮的组织可以使用棉球或者滤纸将组织压在液体内。

2. 植物组织

a.参考动物送样a-c要求；

b.可以剪得稍微大一点1-2厘米的茎，叶片取1*1的大小，植物表面简单清水冲洗，无脏污泥土；

c.硬植物组织建议70%FAA，软植物组织建议50%FAA。

d.横纵切需求：例如肠道横切为环状，纵切为长条状。

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