虽然乳酸以前被视为新陈代谢的副产品，但它是心脏的重要能量基质。乳酸作为线粒体呼吸的重要能量来源和细胞间信号分子，是体内代谢调控的支点。越来越多的证据强调了乳酸在心脏肥大、损伤和心力衰竭中的作用。最近的研究还表明，乳酸可能通过蛋白质乳酸化发挥其生物活性，通过翻译后修饰特定的赖氨酸残基来改变组蛋白或非组蛋白的功能。乳酸是心脏的重要能量底物，α-肌球蛋白重链（α-MHC）与Titin的肌节相互作用对心脏结构和收缩至关重要。然而，在正常和衰竭的心脏中，调节这种相互作用的机制仍然未知。
2023年7月13日，中国医科大学孙英贤教授团队在国际学术期刊Cell Research（IF：44.1）上发表题为“α-myosin heavy chain lactylation maintains sarcomeric structure and function and alleviates the development of heart failure”的研究论文。利用多种先进分子生物学实验和蛋白质组学等技术手段多维度探讨了心脏代谢通过乳酸依赖性修饰α-MHC直接调节肌节结构和功能。具体来说，该研究发现α-MHC在赖氨酸1897上发生乳酸化，调节α-MHC与Titin的相互作用，α-MHC K1897R敲入小鼠中K1897乳酸化的缺失减少了α-MHC-Titin相互作用并导致心脏结构和功能受损。p300和Sirtuin 1分别充当α-MHC的酰基转移酶和脱酰酶。通过化学或基因操作减少乳酸生成可减少α-MHC乳酸化，损害α-MHC-Titin相互作用并加重心力衰竭。相比之下，通过给予乳酸钠（NALA）或抑制心肌细胞中的关键乳酸转运蛋白上调乳酸浓度可以促进α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用，从而缓解心衰。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-023-00844-w
主要内容
1 α-MHC K1897在患有心力衰竭的小鼠和人类中乳酸化减少
通过在小鼠皮下植入渗透性微型泵，并在14天内输注血管紧张素II（Ang II），建立心力衰竭模型。然后，收集对照组和心衰组动物的心脏，进行蛋白质组学分析，以评估蛋白质乳酸化情况（图1a-b）。通过比较对照组和心衰组的乳酸化蛋白和乳酸化位点，发现二者共享142个乳酸化蛋白和483个乳酸化位点，热图分析显示乳酸化变化最大的底物位点是α-MHC K1897（图1c-h）。
下一步，作者试图确认体内α-MHC蛋白乳酸化。与蛋白质组学数据一致，在对照小鼠的心肌组织中检测到α-MHC乳酸化而心衰小鼠心肌组织中α-MHC的乳酸化降低（图1i-j）。接下来，为了研究α-MHC K1897乳酸化的变化，设计了一种特异性识别这种修饰的抗体。与蛋白质组学分析一致，在对照小鼠中检测到α-MHC K1897乳酸化，但在心衰小鼠中降低（图1k-l）。重要的是，在人类病理性心肌样本中，也发现心衰标志物BNP与α-MHC K1897乳酸化呈负相关（图1m-n）。
2 α-MHC K1897R突变减少了α-MHC与Titin的结合，并加重了小鼠的心力衰竭
据报道，α-MHC和Titin之间的相互作用对于维持生理条件下肌球蛋白的稳定性至关重要，心力衰竭时这种相互作用减弱。为了进一步评估α-MHC K1897乳酸化在Ang II诱导的心衰中的作用，作者将赖氨酸AAG密码子突变为精氨酸AGG密码子，构建α-MHC K1897R KI小鼠并给予Ang II诱导心衰（图2a-c）。使用特异识别乳酸化蛋白的Pan Kla以及α-MHC K1897特异性乳酸化抗体，发现Ang II处理显着降低了α-MHC K1897的乳酸化。在α-MHC K1897R KI小鼠中，无论是否进行Ang II处理，都检测不到α-MHC K1897乳酸化（图2d-f)。此外，与WT小鼠相比，α-MHC K1897R KI小鼠的α-MHC-Titin相互作用在生理和病理条件下均显著降低（图2g-h)。
接下来，评估了α-MHC K1897R突变的生理效应。超声心动图显示，在生理条件下，与α-MHC WT小鼠相比，α-MHC K1897R KI小鼠的射血分数（EF）略有降低，而在Ang II条件下，与WT小鼠相比，KI小鼠的EF表现出显着的损害（图2i-j）。Masson染色显示KI小鼠的心肌组织在生理条件下有轻微的纤维化，而Ang II诱导的心肌纤维化在KI小鼠中显着加重（图2k-l)。电子显微镜进一步证实，与WT小鼠相比，KI小鼠的肌原纤维排列轻微紊乱和肌原纤维肿胀，且这些变化因Ang II刺激而显着加剧（图2m)。此外，HE染色和小麦胚芽凝集素染色（WGA）显示Ang II在WT小鼠中引起显着的肥大，在KI小鼠中引起轻度肥大（图2n-o)。在分子水平上，通过评估纤维化标志物，包括SMA、Col-1、以及心肌损伤标志物，包括细胞凋亡相关蛋白cleaved-PARP1、cleaved-Caspase3。所有这些标志物在基线时的KI小鼠中均略有上调，并且在Ang II诱导的心衰中显著上调（图2p-s)。上述结果表明，α-MHC K1897乳酸化的下调直接导致心力衰竭，但没有明显的心肌肥大。
3 p300是α-MHC K1897 乳酸化的酰基转移酶
鉴于α-MHC K1897的乳酸化在心衰中起着关键作用，作者着手确定α-MHC乳酸化的酶促机制。p300被报道可以催化组蛋白的乳酸化作为酰基转移酶。于是，通过体外和体内Co-IP验证了p300与α-MHC的相互作用（图3a-b）。通过使用p300激活剂或p300抑制剂在体内和体外进一步验证了p300激活剂可以增强α-MHC K1897的乳酸化，而p300抑制剂减弱α-MHC K1897的乳酸化（图3c-f)。接下来，探讨了p300在心衰和心肌损伤中调节α-MHC乳酸化的作用。作者发现无论是否有Ang II刺激，p300和α-MHC之间的相互作用在H9c2细胞和小鼠心肌组织中都没有改变（图3g-h)。
为了分析p300对Ang II诱导的心衰中α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用的影响，在体外和体内使用了p300抑制剂或p300激活剂。用p300抑制剂处理的H9c2细胞和小鼠心肌组织均显示基线α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用降低；Ang II减少了α-MHC K1897的乳酸化以及α-MHC 和Titin间的相互作用；与单独使用Ang II刺激相比，p300抑制剂联合Ang II刺激可显著降低α-MHC K1897乳酸化程度以及α-MHC与Titin的相互作用（图3i-L)。另一方面，在p300激活剂治疗组，体外和体内结果均显示p300激活剂增强了α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用，与单独使用Ang II刺激相比，p300激活剂和Ang II刺激的组合可以部分挽救α-MHC K1897的乳酸化和α-MHC-Titin相互作用（图3n–p)。总之，这些结果表明p300是α-MHC K1897乳酸化的酰基转移酶。但是，p300并不是减少心力衰竭中α-MHC K1897乳酸化的关键参与者。
4 SIRT1是α-MHC K1897的脱酰酶
上述结果表明，在Ang II诱导的心衰小鼠模型中，使用p300酰基转移酶激活剂干预未能完全挽救α-MHC K1897乳酸化以及α-MHC-Titin相互作用。为了进一步阐明调控机制，作者想要确定相关的α-MHC K1897脱酰酶。鉴于Sirtuin家族蛋白是关键的脱酰酶，于是选择Sirtuin家族酶（SIRT1–7）作为脱乳酸化α-MHC的候选蛋白，并发现只有SIRT1的表达显著降低α-MHC乳酸化的程度。
通过Co-IP在体内和体外验证了SIRT1和α-MHC之间的相互作用（图4a、b）。接下来，作者使用抗Pan Kla抗体和抗α-MHC K1897抗体来研究SIRT1介导的α-MHC K1897脱乳酸化。通过使用p300激活剂或p300抑制剂在体内和体外进一步验证了SIRT1激活剂会降低α-MHC K1897乳酸化，而SIRT1抑制剂会增强K1897乳酸化（图4c-f)。此外，Ang II刺激减弱了SIRT1与心肌细胞和心肌组织中α-MHC的相互作用（图4g-h）。为了研究SIRT1对α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用在Ang II诱导的心衰中的作用，用SIRT1激活剂抑制剂在体外和体内处理心肌细胞。正如预期的那样，激活剂或Ang II处理下调了α-MHC K1897乳酸化并减少了α-MHC-Titin相互作用，Ang II与激活剂一起处理减弱了α-MHC K1897乳酸化并减少α-MHC-Titin相互作用（图4i-l)。相反，添加SIRT1抑制剂导致α-MHC K1897乳酸化上调并增加α-MHC-Titin相互作用，与单独使用Ang II刺激相比，Ang II刺激与SIRT1抑制剂的加入部分恢复了α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用（图4m-p)。这些结果表明，SIRT1是α-MHC K1897的脱酰酶。然而，SIRT1在心力衰竭中介导α-MHC K1897脱乙酸化并不是必需的。
5 抑制LDHA活性会降低乳酸浓度并抑制α-MHC K1897乳酸化
据报道，LDHA可以调节细胞中乳酸的含量。于是，通过加入LDHA抑制剂，研究了LDHA对α-MHC的调控机制。正如预期的那样，应用LDHA抑制剂后降低了乳酸浓度和心肌细胞、心肌组织中α-MHC K1897的乳酸化（图5a-f)。此外，在心肌特异性LDHA敲除小鼠（LDHA-cKO小鼠）模型上，观察到心肌组织中的乳酸浓度和K1897乳酰酸化降低（图5g-h）。
接下来在Ang II诱导的心衰中探讨了LDHA对α-MHC K1897乳酸化的影响（图5i）。在H9c2细胞中，LDHA抑制剂降低了细胞和培养基中的乳酸浓度。Ang II刺激导致细胞乳酸浓度降低，而其在培养基中的浓度增加。与单独使用Ang II治疗相比，Ang II联合LDHA抑制剂导致细胞和培养基中的乳酸浓度降低（图5i-k）。同样，在小鼠心肌组织中，LDHA抑制剂降低了心肌组织和血清中的乳酸浓度，而Ang II降低了组织中的乳酸浓度。与单独使用Ang II相比，当Ang II与LDHA抑制剂联合使用时，组织和血清中的乳酸浓度降低（图5l-m）。在分子水平上，LDHA抑制剂或Ang II处理减少了α-MHC K1897的乳酸化，并减少了心肌细胞和小鼠心脏组织中α-MHC与Titin的相互作用。与单独使用Ang II治疗相比，当Ang II与LDHA抑制剂联合使用时，α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin在细胞和组织中的相互作用进一步降低（图5n–p）。
6 LDHA-cKO小鼠减少α-MHC K1897乳酸化并加重心力衰竭
为了进一步阐明LDHA在Ang II诱导的心力衰竭中的作用，作者在LDHA-cKO小鼠上，使用Ang II刺激，发现LDHA-cWT小鼠心脏中的LDHA表达略有增加，然而，无论是否给予Ang II，LDHA-cKO小鼠的LDHA表达仍然很低（图6a-c）。在生理条件下，与LDHA-cWT小鼠相比，LDHA-cKO小鼠的α-MHC K1897乳酸化降低，而且在Ang II诱导的心衰中，LDHA-cKO小鼠的α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用降低（图6d-g）。
超声心动图显示，在基线条件下，与LDHA-cWT小鼠相比，LDHA-cKO小鼠的EF略有降低，用Ang II处理的LDHA-cKO小鼠的EF显著下降（图6h-i）。Masson染色显示，在基线条件下，LDHA-cKO小鼠的心肌细胞纤维化与LDHA-cWT小鼠相比略有增加，Ang II刺激显著增加了LDHA-cKO小鼠的纤维化（图6j-k）。透射电子显微镜显示，与LDHA-cWT小鼠相比，LDHA-cKO小鼠的肌原纤维排列和肌原纤维肿胀轻微紊乱，而接受Ang II治疗的LDHA-cKO小鼠肌原纤维排列和肌原纤维肿胀明显紊乱（图6l）。此外，HE染色和WGA染色显示，LDHA-cWT小鼠在Ang II刺激后表现出明显的肥大，而LDHA-cKO小鼠仅表现出轻度肥大（图6m-n）。在分子水平上，与LDHA-cWT小鼠相比，LDHA-cKO小鼠的纤维化和损伤指标略有上调（图6o-r）。这些结果表明，LDHA-cKO中LDHA的缺失降低了心肌组织中的乳酸浓度，下调了α-MHC K1897的乳酸化，从而降低了α-MHC-Titin的相互作用，加剧了Ang II诱导的心力衰竭，而没有明显的心肌肥大。重要的是，在心力衰竭小鼠中LDHA的表达略有增加，表明LDHA可能不是心力衰竭期间α-MHC K1897乳酸化减少的核心操纵因子。
7 NALA增加α-MHC K1897乳酸化并预防心力衰竭
根据以上结果，作者假设心肌细胞中乳酸浓度降低是α-MHC K1897乳酸化降低的主要介质。为了研究这一假设，首先评估了NALA给药对H9c2细胞和小鼠的影响，发现无论Ang II刺激如何，NALA的给予在体外、细胞内和细胞外，以及体内心脏组织和血清中均显著增加乳酸浓度（图7a-c）。此外，NALA在H9c2细胞和小鼠心肌组织中显著上调α-MHC K1897乳酸化，而且在Ang II诱导的心衰下，NALA治疗导致α-MHC K1897乳酸化和α-MHC-Titin相互作用显着增加（图7e-f）。
值得注意的是，NALA略微增加了小鼠的心脏EF，并显着改善了Ang II诱导的心衰的心脏EF（图7g-h）。此外，NALA治疗不影响基线条件下小鼠心肌纤维化的程度和小鼠心肌组织中纤维化标志物的表达（图7i-o）。然而，在Ang II诱导的心衰中，NALA给药后α-SMA、Col-1、Cleaved-Caspase3和Cleaved -PARP1的表达明显下降（图7米m–p）。这些结果表明，心肌细胞和心肌组织中的乳酸缺乏可能是α-MHC K1897乳酸化减少的核心介质，可以通过NALA来挽救。NALA通过增强α-MHC K1897体外和体内的乳酸化显着消除心力衰竭。
8 α-MHC K1897R突变部分消除了NALA对Ang II诱导的心力衰竭的保护作用
接下来，在α-MHC K1897R KI小鼠的Ang II诱导的心衰中给予NALA。结果显示，给予NALA后，无论在Ang II处理的心衰小鼠或α-MHC K1897R KI小鼠中，心肌组织中的乳酸浓度均显著增加；Ang II处理显著降低了α-MHC WT小鼠α-MHC K1897的乳酸化;而在α-MHC K1897R KI小鼠中，无论是否进行Ang II或NALA处理，都检测不到α-MHC K1897乳酸化（图8a-d）。此外，与α-MHC WT组相比，α-MHC K1897R KI小鼠的α-MHC-Titin相互作用显著减少，而NALA仅略微挽救了α-MHC K1897R KI小鼠中Ang II引起的α-MHC-Titin相互作用的减少（图8e-f）。
下一步，探讨了NALA对α-MHC K1897R KI小鼠Ang II诱导的心力衰竭的生理效应。通过超声心电图、Masson染色、HE染色和WGA染色及小鼠纤维化和损伤指标检测，说明NALA对α-MHC WT小鼠的心力衰竭有治疗作用，但α-MHC K1897R部分取消了NALA在体内对Ang II诱导的心力衰竭的保护作用。
9 MCT4抑制剂VB124增加α-MHC K1897乳酸化并预防心力衰竭，α-MHC K1897R突变部分消除了VB124对Ang II诱导的心力衰竭的保护作用
作者试图抑制心肌细胞中的关键乳酸转运蛋白MCT4，以进一步阐明上述分子机制。在α-MHC WT组中，在给予Ang II后，α-MHC K1897乳酸化显著降低，VB124处理后显著增加，而α-MHC K1897乳酸化在α-MHC K1897R KI小鼠中几乎检测不到（图9a-c）。在α-MHC WT组中，Titin与α-MHC之间的相互作用在给予Ang II后显著降低，但在给予VB124处理后显着增加。然而，在Ang II处理下，与α-MHC WT组相比，α-MHC K1897R突变逆转了VB124对α-MHC-Titin相互作用的上调（图9d-e）。
接下来，通过超声心电图、Masson染色、HE染色和WGA染色及小鼠纤维化和损伤指标检测，说明MCT4抑制剂对α-MHC WT小鼠的心力衰竭也有治疗作用（图9f-o）。与NALA的结果一致，α-MHC K1897R在体内部分消除了MCT4抑制剂对Ang II诱导的心力衰竭的保护作用。
研究总结
综上所述，研究揭示了心力衰竭期间α-MHC K1897乳酸化减少的核心原因。研究结果确定了四个因素，p300、SIRT1、LDHA和细胞内乳酸浓度，是心力衰竭期间α-MHC K1897乳酸化的调节因子。该项研究表明，α-MHC K1897乳酸化调节α-MHC与Titin之间的相互作用，并且α-MHC K1897乳酸化的减少易发生心力衰竭。重要的是，心力衰竭患者心肌细胞中乳酸浓度的降低可能是α-MHC K1897乳酸化降低的主要原因。此外，NALA和MCT4抑制剂上调α-MHC K1897乳酸化并缓解心力衰竭。总的来说，心肌乳酸通过α-MHC乳酸化直接调节肌节结构和功能，这可以作为心力衰竭的新治疗策略。
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