代谢异常是癌症的标志。即使有氧气存在，大多数癌细胞也对有氧糖酵解上瘾。这种代谢改变，也被称为“Warburg效应”，它可以启动微环境并导致糖酵解中间体(如乳酸)的升高，以支持细胞增殖。有证据表明，乳酸参与调节多种生物过程，如免疫细胞分化、肿瘤免疫监视、纤维化、缺血性损伤，并通过一种被称为乳酸化的表观遗传修饰调节基因表达。且乳酸可以共价修饰蛋白质，但细胞内乳酸被检测并转化为乳酸化的机制尚不清楚。
肿瘤抑制因子p53介导多种功能。作为一种转录因子，它通过激活许多控制DNA修复、细胞周期进程和应激下存活的靶标来保护细胞免受恶性转化。p53的活性在肿瘤发生过程中经常被抑制，超过一半的人类癌症含有p53突变，损害p53肿瘤抑制活性。p53的活性也受翻译后修饰的调控，如磷酸化、乙酰化和泛素化。了解p53调控的机制可能会拓宽癌症患者的治疗策略，以提高p53的活性。
2024年4月22日，苏州大学周芳芳课题组在国际顶级学术期刊Cell（IF：45.5）上在线发表题为“Alanyl-tRNA synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis”的研究论文。该研究以肿瘤的Warburg效应的背景，通过分析蛋白质组学数据，鉴定到包括p53在内的大量靶标，全面解析了AARS1乳酸化p53从而促进肿瘤发生的机制。
该研究首先发现肿瘤来源的乳酸是p53的天然抑制因子，可促进p53的乳酸化。进一步鉴定到细胞内的乳酸传感器和乳酸转移酶——丙氨酸tRNA合成酶（AARS1），发现其可直接与乳酸结合并催化全局赖氨酸乳酸化。在机制研究方面，利用蛋白质组学、荧光素酶报告检测、CRISPR筛选和疾病动物模型等方法，系统阐明AARS1介导其DNA结合域(DBD)的位点特异性p53乳酸化，阻止p53与含有p53应答元件(p53RE-DNA)的DNA结合，从而抑制p53液-液相分离(LLPS)和转录。此外，还鉴定出β-丙氨酸与乳酸竞争结合AARS1，从而加强癌症化疗。这些发现提示我们，全面了解AARS1的功能及其功能障碍的后果可能会为多种人类疾病的机制提供见解。
原文链接:
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867424003970?via%3Dihub
主要内容
1 肿瘤源性乳酸是一种天然的p53抑制因子，可促进p53的乳酸化
通过评估TCGA乳腺癌数据集，作者发现在携带野生型p53的患者中，具有高血清乳酸水平基因特征的患者p53信号通路得分明显较低(图1A)，表明肿瘤中的乳酸可能抑制p53功能。为了研究乳酸在体内的作用，构建小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)-多瘤中T抗原(PyMT)转基因乳腺癌模型，并向NSG小鼠腹腔注射乳酸钠(乳酸的基本形式)，发现乳酸钠注射影响肿瘤的早期形成，肿瘤体积明显增大(图1B)，提示细胞内乳酸积累可能促进肿瘤进展。此外，在给予乳酸钠的小鼠肿瘤中，p53活性被显著抑制(图1C)。
乳酸脱氢酶A (LDHA)将丙酮酸转化为乳酸，在乳腺癌患者中，LDHA的高表达与生存率低相关。为了进一步验证上述发现，作者将表达MMTV驱动的Cre -重组酶的PyMT动物与含有loxP位点的Ldha等位基因纯合的动物(Ldhafl/fl)杂交，从而实现乳腺上皮中单等位基因Ldha的组成性缺失(图1D)。LDHA缺失导致肿瘤形成延迟(图1E)，降低肿瘤负荷(图1F)，增加p53活性(图1G)。此外，使用糖酵解抑制剂2-DG或LDHA抑制剂草酸酯阻断内源性乳酸的产生，可显著增加肿瘤细胞中p53靶基因的表达，肿瘤细胞表达野生型p53 (p53+/+)，而不是p53-/-(图1H)。与此一致的是，在p53+/+细胞中，乳酸处理可以抑制由MDM2抑制剂Nutlin-3诱导的内源性p53激活(图1I)。总的来说，这些发现表明肿瘤来源的乳酸是p53的天然抑制因子。
为了确定乳酸是否能在体外直接拮抗p53，作者采用基于荧光素酶互补分析(LCA)的无细胞系统测量p53活性，发现乳酸或乳酸钠的孵育没有改变p53的活性，而添加细胞裂解液导致p53活性降低，这与它们的乳酸化水平升高相关(图1J)。细胞裂解液的需求表明p53的乳酸化可能依赖于裂解液中的某些蛋白质。在LCA测试中，p53的乳酸化程度与其活性的丧失相关(图1K)。总之，这些发现表明，细胞可以感知乳酸并将其转化为p53的乳酸化，使p53失活(图1L)。
2 全基因组CRISPR筛选发现AARS1是肿瘤细胞中赖氨酸乳酸化的中介
为了确定负责p53乳酸化的蛋白质，作者进行了全基因组CRISPR筛选，筛选结果表明，Alanyl-tRNA合成酶1 (AARS1)被确定为与乳酸化修饰相关性最强的蛋白(图2A-B)。接下来，使用蛋白质组学方法分析了全局赖氨酸乳酸化蛋白组(图2C)，发现乳酸诱导的乳酸化蛋白组被AARS1敲低抑制(图2D)。在短暂耗尽AARS1后，大约80%的lactyl-lysine (klacc)肽和蛋白的强度下降(图2E)，其中高达10%的肽和蛋白的强度下降超过10倍(图2F)。相反，过表达AARS1强烈增强了整个赖氨酸乳酸酶(图2G)。在HsAlaRS过表达的细胞中，90%的乳酸化肽和蛋白的强度显著增加，近50%的乳酸化肽和蛋白的强度增加了10倍以上(图2H和2I)。这些结果表明AARS1是细胞中赖氨酸乳酸化的中介。
AARS1在许多物种中都是保守的，包括大肠杆菌(图2J)。细菌酶EcAlaRS的过表达也增强了细胞中整个赖氨酸乳酸酶(图2K-2M)。此外，对人类HsAlaRS和EcAlaRS的靶点和蛋白进行比较，发现两者存在大规模的重叠(图2N)。这些观察结果表明，AARS1可能在催化赖氨酸乳酸化中起着古老的作用，并在从原核生物到哺乳动物的各种物种中都是保守的。
有文献报道，丙氨酸可以作为底物结合AARS1，且β-丙氨酸在结构上与乳酸相似，被广泛用于改善运动表现。有趣的是，用β-丙氨酸预处理的细胞显示赖氨酸乳酸酶急剧减少(图2O)。与AARS1缺失的细胞类似，在β-丙氨酸处理的细胞中，大约90%的乳酸化肽和蛋白质的强度降低，其中10%的强度降低超过10倍(图2P和2Q)。因此，当比较受调节的乳酸化肽时，AARS1的化学抑制反映了AARS1被siRNA耗尽的情况(图2R)。总之，这些结果表明AARS1也可能使用乳酸作为乳酸化的底物，因此β-丙氨酸可以有效地对抗这一过程。
3 AARS1直接结合乳酸并以ATP依赖的方式促进赖氨酸的乳酸化
接下来，作者试图揭示AARS1介导乳酸化的潜在机制。首先，微尺度热泳(MST)分析显示从细菌中纯化的EcAlaRS和HsAlaRS与乳酸结合(图3A)，表明EcAlaRS和HsAlaRS可以利用乳酸作为底物直接催化乳酸化。且如图3B-C所示，β-丙氨酸可以有效地降低乳酸- EcAlaRS和乳酸- HsAlaRS之间的结合。接下来，为了确定结合位点，通过分子对接，发现HsAlaRS中的一些保守残基(M46、R77、N216和D239)和EcAlaRS (M43、R69、W170、N212和D235)与乳酸形成直接接触(图3D)。将这些残基中的一个或两个突变为丙氨酸会减少乳酸的结合，而同时突变所有这些保守残基（EcAlaRS-6A和HsAlaRS-5A）则取消了结合（图3E-F）。
为了测试AARS1是否直接催化赖氨酸乳酸化，作者用细胞裂解液孵育纯化的EcAlaRS。发现只有在反应中加入乳酸和ATP后，EcAlaRS-WT才能增强细胞裂解物中赖氨酸的整体乳酸化(图3G)，而缺乏乳酸或ATP结合的突变体则没有，且编辑活性降低的突变体EcAlaRS-C666A在促进乳酸化方面与EcAlaRS-WT具有相似的效率(图3H)，表明不需要编辑活性。同样，HsAlaRS-WT和HsAlaRS-C723A(与AlaRS-C666A同源)，而不是缺乏乳酸或ATP结合的突变体(HsAlaRS-5A或HsAlaRSR77A&G243A)，增加了赖氨酸乳酸酶(图3I-3K)。因此，EcAlaRS和HsAlaRS在ATP依赖性乳酸转化为乳酸化过程中具有相同的保守功能。
接下来，使用质谱来表征EcAlaRS依赖性赖氨酸乳酸组(图3M-Q)，其中包括1704种具有不同亚细胞分布的蛋白质中的4544个klacc位点。将klacc位点周围的氨基酸序列与人类蛋白质组背景进行比较，发现大多数位置明显倾向于带正电的赖氨酸，而半胱氨酸和亮氨酸则代表性不足。此外，丝氨酸和脯氨酸分别在-1和+3位点高度富集，脯氨酸和谷氨酸在+1位置富集的频率较低。且大多数含有klacc的蛋白参与涉及DNA和RNA的细胞和代谢过程。
4 通过催化ATP依赖性乳酸- AMP的形成，AARS1将乳酸转移到赖氨酸上共价结合
上述实验已经证明p53可发生Kla，在这里作者重点探究AARS1是否介导了该过程。作者首先检索了来自p53相互作用蛋白的公开质谱数据，发现AARS1和目前已知的p53结合蛋白存在相互作用(图4A-D)。接下来，作者在转染AARS1并经乳酸钠刺激的细胞中通过质谱鉴定出p53在K120和K139位点发生乳酸化(图4E-F)，使用p53的位点特异性抗体也证实了内源性p53的这些残基发生了乳酸化(图4G)，乳酸或乳酸钠刺激了这些残基，2-DG和草酸盐抑制了这些残基(图4H-I)。
为了探索ARS家族的其他成员是否可能发挥与AARS1相似的作用，作者评估了耗尽所有p53相互作用ARS对p53活性的影响。只有来自AARS1缺失细胞的裂解物不能使p53乳酸化或失活(图4J)，这表明AARS1是p53的主要乳酸转移酶。在细胞中，共表达的HsAlaRS-WT，而不是HsAlaRS-5A或HsAlaRS-
R77A&G243A，有效地使p53乳酸化，并被β-丙氨酸抵消(图4K)。通过siRNA介导的基因敲低或单等位基因缺失抑制AARS1，有效抑制了宿主细胞对乳酸盐诱导的p53乳酸化反应（图4L），进一步证实了AARS1介导了p53乳酸化。
在体外，EcAlaRS-WT或HsAlaRS-WT，而不是它们的乳酸或ATP结合缺陷突变体，在K120和K139处使p53乳酸化，且这些反应被β-丙氨酸抑制(图4M)。结合这些结果和结构分析，作者提出乳酸在AARS1介导的乳酸化中的作用是:首先，乳酸在AARS1中被ATP分子激活，形成反应性乳酸-磷酸键的中间产物乳酸-AMP，并释放无机焦磷酸盐(PPi)。其次，活化的乳酸共价附着在赖氨酸受体端，同时释放AMP。根据这一点，作者检测了乳酸和ATP与EcAlaRS-WT或HsAlaRS-WT孵育后乳酸-AMP的形成和PPi的释放 (图4N)。值得注意的是，在反应中加入底物p53会消耗乳酸-AMP，同时产生AMP(图4M-N)。综上所述，可以推断AARS1是一种进化上保守的酶，它催化ATP依赖性乳酸- AMP的形成，乳酸可以通过该酶共价转移到靶蛋白的赖氨酸上(图4O)。
5 p53的位点特异性乳酸化减弱了它们的DNA结合和LLPS，从而降低了p53在体外和体内的肿瘤抑制作用
接下来，作者探讨了位于p53 DBD的K120和K139位点的乳酸化调控其活性的分子机制(图5A)。首先作者利用一种创新的遗传密码扩展策略生成了位点特异的p53乳酸化突变体。接着，通过使用这些突变体进行细胞和动物实验，令人惊讶的是，这些突变体表现出DNA结合受损、LLPS减弱和转录活性降低的特征(图5B-H)，并且在荷瘤小鼠中展现出更强的致瘤性，最终导致肿瘤发生(图5N)。
为了在细胞中验证这些体外研究结果，作者评估了表达FlagLac-p53 (p53-WT)和Flag-p53Lac (p53K120-Lac，p53K139-Lac或p53-/-) p53Lac胞(图5I)。发现Flag-p53Lac蛋白在刺激下不能结合p53RE-DNA，也不能凝聚成离散的核点(图5J-K)，并且在驱动p53应答报告基因和靶基因的表达方面效率低下(图5L)。此外，p53-DBD-WT而不是p53-DBDLac与mCherry-Cry2的融合使蓝光诱导的细胞斑点形成(图5M)，证实了乳酸化也损害了细胞中的LLPS。总之，利用一种产生位点特异性乳酸化蛋白的方法，证明了p53乳酸化在肿瘤发生中的生理意义(图5O)。
6 与疾病相关的 K120 和 K139 变体可模拟乳酸化作用，从而降低 LLPS 和抑制肿瘤生长
p53-DBD突变构成了在一系列恶性肿瘤中常见的“热点”，对TP53数据库和COSMIC的分析显示p53存在包括K120N、K120Q、K120E、K139N、K139T、K139Q和K139E在内的癌症相关突变位点(图6A-B)。Lys突变为Asn, Thr, Gln，尤其是Glu，减少了其正电荷，模拟了相应的Lys残基的乳酸化(图6B)。且研究表明p53-K120N可能无功能，这些乳酸化模拟变异可能有助于肿瘤发生 (图6C)。为了支持这一观点，作者发现纯化的K120N/Q/E和K139N/T/Q/E突变体对p53RE-DNA的结合亲和力降低，K120E和K139E的减少更为明显(图6D-E)，表明K-to-E突变导致更强的电荷减少。此外，K120N/Q和K139N/T/Q部分丧失了刺激p53应答性基因表达的能力，而K120E和K139E几乎完全丧失(图6F)。这些变异在LLPS和活动能力方面也受到损害(图6G-H)。
此外，实验发现p53-WT，而不是K120E和K139E变体，抑制细胞增殖、克隆形成和异种移植肿瘤生长(图6I-6L)。这些与癌症相关的p53变异也表现出与p53RE-DNA相互作用减少，从而阻止p53 LLPS和激活(图6M)。这一发现为在各种恶性肿瘤中观察到的突变型p53变体的功能损害提供了机制解释。
7 在肿瘤生长过程中，AARS1介导p53的乳酸化，可被β-丙氨酸有效拮抗
AARS1表达在许多肿瘤类型中升高，并且与WT p53患者的低生存率相关(图7A-B)。动物实验表明，AARS1减少的MMTV-PyMT小鼠比野生型小鼠更晚发生肿瘤，并表现出更低的原发性肿瘤负担(图7C-D)。值得注意的是，在Aarsfl/+ Cre中，肿瘤乳酸浓度与肿瘤负荷呈显著正相关。而在Aarsfl/+ Cre+ MMTV-PyMT小鼠中则没有(图7E)。此外，在Aarsfl/+ Cre+ MMTV-PyMT小鼠的肿瘤中，p53在K120和K139处的乳酸化降低(图7F)，并且从Aarsfl/+ Cre+肿瘤中分离的细胞对乳酸介导的p53抑制反应较弱(图7G)。总之，这些发现表明AARS1在体内介导p53失活并促进肿瘤发生。
为了解决研究结果的临床相关性，使用患者来源的组织样本检测蛋白质组乳酸化、p53乳酸化和AARS1表达的状态。对肿瘤切片及邻近正常组织进行免疫组化，该分析显示，在恶性肿瘤中，AARS1和蛋白组(lactyl-K)和p53 (lactylp53 K120)的乳酸化均显著上调(图7H-7J)。与上述结果一致，在TCGA脑肿瘤中，AARS1的表达也与p53活性呈显著负相关(图7K)，并在15个新鲜脑肿瘤样本中证实了这一点(图7L)。总之，这些发现表明，在人类癌症中，包括乳酸化p53在内的赖氨酸乳酸化是由AARS1调节的。
进一步地，为了抑制肿瘤中p53的乳酸化，作者测试了目前广泛使用的运动补充剂β-丙氨酸，结果显示它可以作为AARS1介导p53乳酸化的抑制剂，可防止p53失活并提高癌症化疗的疗效(图7M-7P)。
研究总结
总之，该研究团队的工作揭示乳酸是肿瘤细胞产生的一种天然的p53抑制分子。机制上，乳酸会通过修饰p53蛋白来降低其结合DNA的能力并阻碍p53的液-液相分离，从而抑制了p53的转录活性和抑癌功能，而丙氨酸-tRNA合成酶AARS1则是催化乳酸形成乳酰化修饰的中介。这项开创性的研究不仅揭示了一种将细胞代谢与p53功能联系起来的新的调节机制，而且提供了令人兴奋的治疗机会。通过靶向AARS1-介导的乳酸化，研究人员可能能够恢复p53的肿瘤抑制活性，为癌症治疗策略开辟新的途径。此外，AARS1作为一种乳酰基转移酶的鉴定扩展了我们对翻译后修饰调控格局的理解，为进一步探索代谢和蛋白质功能在各种生物过程中的相互作用铺平了道路。
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