江苏省中国科学院植物研究所梁呈元研究员团队揭示蓝光调控蒲公英菊苣酸生物合成的分子机制

学术 2024-12-18 07:05 上海

近日，江苏省中国科学院植物研究所梁呈元研究员团队在国际著名学术期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“TmCOP1-TmHY5 module-mediated blue light signal promotes chicoric acid biosynthesis in Taraxacum mongolicum”的研究论文。该研究通过转录组和代谢组联合分析，确定蓝光显著促进菊苣酸的合成并建立了蓝光信号-转录因子-关键酶基因调控网络；通过体内和体外试验明确了蓝光诱导的TmHY5显著促进了菊苣酸、木犀草素和花青素的生物合成；受蓝光抑制的TmCOP1在黑暗条件下促进TmHY5的泛素化降解进而抑制菊苣酸的生物合成；揭示了TmCOP1-TmHY5光信号核心模块介导蓝光信号调控蒲公英中菊苣酸生物合成的分子机制。研究团队推测，蓝光补光技术可以有效地增强光合植物中菊苣酸的积累，为药食同源植物蒲公英的栽培奠定理论基础。

菊苣酸是一种重要的酚酸化合物，存在于菊苣、蒲公英、紫锥菊和向日葵等60多种植物中。这些物种多具有强光适应性和可食用等特点。菊苣酸具有多种药理活性，包括增强免疫功能、抗炎作用，抗高血糖特性和保护胶原蛋白免受自由基的侵害等。因此，在现代社会，食用富含菊苣酸的食物有助于改善人类亚健康状态并提高生活质量。在药食同源植物蒲公英中，已有多个基因组和转录组数据公布，已建立断根遗传转化体系及CRISPR敲除系统，从而为菊苣酸生物合成及其转录调控网络的研究提供了坚实基础。

光是植物生长所必需的环境因素，不同光质显著影响多酚在植物中的积累，COP1-HY5模块是经典的光信号组件，参与植物根系的形成、花青素的生物合成以及萜类化合物合成。COP1在黑暗条件下从细胞质转运到细胞核，进而降解包括HY5在内的多种蛋白。因此，我们推测COP1-HY5模块可能在蒲公英菊苣酸的生物合成中具有相似的功能。

在这篇文章中，我们初步研究了各种光照条件对蒲公英菊苣酸生物合成的影响，证实了TmHY5可以直接调控菊苣酸生物合成关键酶基因的表达，同时激活TmbZIP1转录因子介导ABA信号间接促进菊苣酸的积累。相反，TmCOP1直接与TmHY5相互作用并降低菊苣酸生物合成。蓝光减少TmCOP1蛋白的积累进而抑制TmCOP1-TmHY5蛋白复合物的形成，同时通过激活TmHY5正调控TmCOP1基因的表达形成反馈调节。本研究阐明了TmCOP1-TmHY5-Tm4CL1模块介导蓝光信号促进蒲公英中菊苣酸生物合成。

全文主要研究结果如下：

1. 蓝光促进蒲公英中菊苣酸的生物合成

通过对白光(W)、红光(R)和蓝光(B)处理20d 蒲公英的代谢组分析，差异代谢物(DAM)共计812个（图1A）。R_vs_B中差异代谢物最多，且苯丙氨酸合成和代谢途径差异最显著（图1B）。共鉴定到52种酚酸类化合物，其中菊苣酸，咖啡酰酒石酸和奎尼酸在蓝光中显著高于红光（图1C）。转录组分析表明，R_vs_B中共注释到1424个差异表达基因并在蓝光中显著上调，其中苯丙氨酸和黄酮类化合物合成途径关键酶基因共注释到41个成员（图1D）。因此，基于转录组和代谢组联合分析，确定4-香豆素-CoA连接酶（4CL）、查耳酮合酶（CHS）、羟基肉桂酸：奎尼酸羟基肉桂酰基转移酶（HQT）和羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）与菊苣酸含量高度相关（图1E、1F）。进一步构建了29个光信号通路蛋白，89个差异表达的TFs和41个多酚类合成酶基因的调控网络（图1G）。TmHY5（bZIP）和TmPIF3（bHLH）与其他成员的连接效率最高。然而，只有TmHY5同时与光信号、TFs和对蓝光有反应的多酚合酶基因相关，这表明它在调节多酚化合物中的潜在作用，值得进一步研究。

图1 代谢组和转录组联合分析表明，TmHY5可能介导了蓝光信号调控蒲公英菊苣酸的合成

2. 改变TmHY5的表达显著影响了菊苣酸、木犀草素和花青素的生物合成

TmHY5是bZIP家族H亚家族成员的核定位转录因子（图2A、2B）。启动子分析及qRT-PCR结果表明TmHY5的表达受蓝光诱导，在花中高表达，且受到ABA、NaCl的正向调控并受到GA的负调控，因此TmHY5参与了蒲公英中的复杂信号网络调控（图2C）。与对照相比，过表达株系中叶柄部分颜色更红（图2D）。同时TmHY5-OE2转基因蒲公英中菊苣酸是对照的1.7倍，OE-1和OE-2中的木犀草素浓度也显著增加（图2E）。基于这些发现，我们假设TmHY5介导蓝光和ABA信号，调节蒲公英多酚生物合成途径中下游代谢物的生物合成。共鉴定了三个CR株系，包括CR#6（双等位基因突变）、CR#9（纯合突变）和CR#19（杂合突变）（图3A）。与对照相比，所有三个TmHY5敲除株系中都表现出显著的表型差异，其生长状态明显较低（图3B）。CR#9株系中菊苣酸浓度最低是对照组的0.50倍；同时，CR#9和CR#19的木犀草素浓度显著降低了0.48倍和0.32倍，且花青素含量也显著降低（图3C）。综合这些结果，我们推测TmHY5基因的过表达和CRISPR-Cas9株系中多酚生物合成途径化合物的积累表现出相反的趋势。

图2 过表达TmHY5促进蒲公英菊苣酸、木犀草素和花青素积累

我们选择OE-2和CR#9进行进一步的转录组分析，氧化还原酶活性、跨膜转运蛋白活性和转运蛋白活性是三个最丰富的GO类别，KEGG三种主要途径分别是苯丙烷生物合成、黄酮生物合成和植物激素信号转导（图3D、3E）。OE-2株系中TmPALs、TmC4Hs、Tm4CLs和TmHQTs的表达水平显著高于CR#9株系，这与菊苣酸积累密切相关（图3F）。在植物激素信号转导途径中，生长素信号通路（AUX1、AUX/IAA、ARF和GH3）和ABA信号通路（PP2C、SnRK2s、ABFs）受到的调节最为显著。此外，OE-2株系中油菜素内酯、水杨酸和赤霉素途径中关键成员，如BR激活的转录因子（BZR1/2）和GA诱导的DWARF1（GID1）等基因表达水平也有所升高；OE-2中有38个转录因子上调，而CR#9中有19个转录因子上调（图3G）。综上所述，TmHY5调节菊苣酸、木犀草素和花青素的生物合成，主要调控靶点、信号转导通路和转录调控网络已从OE/CR转录组数据中初步确定。

图3 蒲公英TmHY5敲除株系的鉴定及OE/CR株系的转录组分析

3. TmHY5直接结合TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2的启动子调控菊苣酸的生物合成

在TmHY5-OE2株系中，TmPAL1/3/4、TmC4H1、Tm4CL1和TmHQT2的表达水平显著高于CR#9系（图4A）。因此，TmHY5的过表达导致蒲公英的菊苣酸水平升高。除了受蓝光显著影响的Tm4CL1外，TmHY5的下游靶基因还包括TmPAL1/3/4、TmC4H1和TmHQT2。LUC活性检测表明，TmHY5转录因子显著增强了TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2报告子的表达（图4B）。启动子序列的分析表明，TmHY5结合TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2的启动子上的G-box和AREB motif，导致SD/-Trp/-Leu/+X-gal呈蓝色（图4C）。进一步通过电泳迁移率变化分析（EMSA），使用G-box和AREB motif作为生物素标记探针，检测到DNA-TmHY5蛋白复合物（图4D、4E）。冷竞争探针的存在降低了TmHY5与标记探针的结合。这些结果表明TmHY5与TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2启动子中的G-box和AREB motif结合，参与了菊苣酸及其前体化合物的生物合成。这些结果表明，TmHY5上调了TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2基因的表达进而增强了菊苣酸及其前体的积累。

图4 TmHY5直接结合TmPAL3、Tm4CL1和TmHQT2的启动子调控菊苣酸的生物合成

4. TmCOP1与TmHY5相互作用，蓝光抑制TmCOP1-TmHY5蛋白复合物的降解

TmCOP1蛋白包含三个结构域：RING（氨基酸74-120）、卷曲螺旋（氨基酸53-324）和WD40重复（氨基酸371-575），酵母双杂交结果表明，TmCOP1的WD40重复结构域（371-575）直接与TmHY5相互作用。此外，TmHY5前端氨基酸1-91直接与TmCOP1相互作用，进一步Y2H结果表明TmCOP1和TmHY5的结合位点分别是TmCOP1（371-575）和TmHY5（46-51）（图5A）。LCI和BiFC实验证实了TmCOP1和TmHY5在烟草中的相互作用（图5B、5C）。此外，pull-down实验表明，TmHY5和TmCOP1可以体外互作（图5D）。综上所述，TmCOP1和TmHY5蛋白可以在体内和体外相互作用，结合位点为TmCOP1（371-575）和TmHY5（46-51）。

过表达TmCOP1的转基因系中，OE2株系的绿原酸、酒石酸和菊苣酸浓度最低；同样，芦丁、木犀草素和花青素的浓度也呈现出类似的趋势（图S4）。因此，TmCOP1负调控蒲公英菊苣酸的生物合成。在蓝光和白光条件下，含有AD-TmCOP1和BD-TmHY5质粒的重组Y2H酵母未能正常生长（图5E）。在黑暗条件下，重组Y2H酵母表现出较好的生长。然而，在红光条件下，酵母生长减弱，这表明不同的光照显著影响重组Y2H酵母中TmCOP1-TmHY5蛋白复合物的稳定性。蛋白质印迹分析表明白光增加了TmCOP1-GFP融合蛋白的降解，同时TmCOP1-GFP-在蓝光处理下表现出类似的趋势（图5F）。基于这些发现，我们推测蓝光增强了TmCOP1的降解，从而抑制TmCOP1-TmHY5蛋白复合物的形成，增加了菊苣酸、木犀草素和花青素的生物合成。这项研究不仅解析了蓝光调控蒲公英菊苣酸生物合成的转录调控机制，也为利用蓝光补光技术在药用植物中的应用奠定基础。

图5 TmCOP1与TmHY5的相互作用、蓝光抑制TmCOP1-TmHY5蛋白复合物形成

江苏省中国科学院植物研究所为该论文的第一署名单位，江苏省中国科学院植物研究所刘群助理研究员为论文第一作者，已毕业硕士研究生吴志清参与了主要研究工作。江苏省中国科学院植物研究所梁呈元研究员、浙江中医药大学开国银教授、吉林农业大学郜玉钢教授为该论文的共同通讯作者。研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金和江苏省植物资源研究与利用重点实验室等项目的资助。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14542

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