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来源：PBJ
近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了由河北农业大学董利利、张利辉团队撰写的“Rational design of azo-aminopyrimidine derivatives as the potent lepidoptera-exclusive chitinase inhibitors”论文。该研究工作聚焦绿色靶标亚洲玉米螟几丁质酶OfChi-h，采用基于计算机辅助的靶标结构合理设计策略成功开发出了对亚洲玉米螟几丁质酶OfChi-h具有高度抑制活性的氨基嘧啶化合物10a。进一步，通过包括荧光淬灭、分子对接、分子动力学模拟、杀虫活性实验、SEM表型成像、盆栽实验、天敌安全性评价、口服毒性预测等多维度的方法系统评价了化合物10a作为新型昆虫生长调节剂的有效性和安全性。研究团队报道的这一新型偶氮氨基嘧啶类化合物为鳞翅目农业害虫的绿色高效防治提供了一种新的解决方案，具有较好的应用前景。
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亚洲玉米螟（O. furnacalis）是一种常见的农业害虫，可严重影响玉米的产量和品质，建立和实施有效的亚洲玉米螟防治方法具有重要意义。化学杀虫剂仍然是减轻亚洲玉米螟危害的最有效手段，但传统化学农药存在的毒性和害虫抗性问题日益突出。因此，开发新型、高效且环保的农药显得尤为重要。几丁质作为一种由β-1,4-连接的N-乙酰氨基葡萄糖单体组成的高聚物，广泛地存在于诸如亚洲玉米螟、小菜蛾、草地贪夜蛾等农业害虫的外表皮及肠道壁中。害虫几丁质的代谢与其正常生长发育密不可分，而人类、高等动物和植物不含几丁质(Hardardóttir et al., 2019; Saguez et al., 2006 Zhu et al., 2016)。因此，通过抑制几丁质代谢实现害虫防治是一种有前景的开发绿色农药策略（Rabadiya et al., 2024）。在昆虫几丁质水解代谢过程中，几丁质酶可高效地将几丁质降解为几丁寡糖。抑制昆虫几丁质酶会导致导致昆虫蜕皮紊乱、生长抑制、蛹化异常，最终会导致昆虫的死亡。其中，几丁质酶Chi-h与细菌来源的几丁质酶具有高达70%的同源性，是鳞翅目昆虫所独有的通过基因水平转移获得的几丁质酶。考虑到鳞翅目昆虫是最具破坏性的一类农作物害虫，而大多数的益虫（如寄生蜂和蜜蜂）不存在Chi-h（Liu et al., 2017）。因此，开展以鳞翅目昆虫几丁质酶Chi-h为靶标的新型抑制剂的研发具有重要的靶标特异性优势。河北农业大学董利利、张利辉团队围绕亚洲玉米螟来源的几丁质酶OfChi-h，开展了基于绿色靶标的农药分子虚拟筛选及合理设计工作，成功得到了一类结构新颖、生物活性高效、生物安全性有保障的偶氮氨基嘧啶类抑制剂分子，为具有自主知识产权的绿色杀虫剂的开发奠定了重要研究基础。全文的主要研究结果如下：
1. 目标化合物9a-9i和10a-10g的设计与合成研究者在之前的研究中通过虚拟筛选的策略得到了偶氮氨基嘧啶化合物8f对OfChi-h 表现出高抑制活性(Dong et al., 2022)。通过分子对接研究8f与OfChi-h的作用模式发现8f侧链的苄基苯环可以与OfChi-h的疏水残基形成π-π堆积作用，并且该位置能够容纳较大的疏水片段。为进一步提高偶氮氨基嘧啶类化合物的酶抑制活性及体外杀虫活性，研究者对先导化合物8f进行了两个方面的结构优化，一方面在8f的苄基苯环上引入含氟官能团（化合物9a-9i），拟提升化合物的膜通透性和生物利用度；另一方面，在8f的嘧啶4位引入了大的疏水基团，包括长链烷基和芳香环（10a-10g），拟增强化合物与靶酶的结合亲和力及优化其亲脂性和膜渗透性 (图1)。通过化学合成成功得到了两个系列的偶氮嘧啶类化合物9a-9i和10a-10g。2. 化合物9a-9i和10a-10g对OfChi-h的抑制活性及杀虫活性分析研究者在1μM浓度下评价了目标化合物9a-9i和10a-10g对靶酶OfChi-h的抑制活性。与8f相比，引入氟原子可明显提高化合物的酶抑制活性。初步构效关系表明化合物苄基苯环上氟取代基的活性顺序为对位>邻位>间位（9b>9c>9a）。随着苯环上吸电子基团数量的增加，抑制活性逐渐降低(9d>9e)。此外，引入强吸电子的-CF3和-OCF3基团会略微降低化合物的抑制活性（9f, 9h<8f），其中引入4-F基团的化合物9b对OfChi-h的抑制活性最高，IC50值为0.1μM (图2a)。此外，研究者发现在先导化合物嘧啶的4位引入较大的疏水基团（长链烷基和芳香环）会进一步增加化合物对OfChi-h的酶抑制活性。其中，带有正丁基(10a)和4-苯氧基(10g)基团的化合物对OfChi-h表现出强效抑制；与带有萘基(10c-10d)的抑制剂相比，在嘧啶4位氨基上带有联苯(10e-10f)的抑制剂具有更好的活性；同时将取代基从1-萘基（10c）替换为2-萘基（10d）可使其抑制活性提高2倍。化合物10a和10g对OfChi-h的IC50值分别为0.07 μM和0.09 μM(图2b)。这些结果表明在化合物的嘧啶4位引入适当的含氟基团、疏水基团和芳香基团有助于增强其对OfChi-h的抑制效果，从而验证了改造策略的准确性。研究者测定了偶氮氨基嘧啶化合物9a-9i和10a-10g对亚洲玉米螟和小菜蛾的杀虫活性。在500 mg/L浓度下，大多数目标化合物对亚洲玉米螟具有良好的杀虫活性，所有化合物的杀虫活性均大于95%。随后研究者在200 mg/L和50 mg/L浓度下评估了目标化合物的杀虫活性，发现大部分化合物在200 mg/L浓度下对亚洲玉米螟和小菜蛾的致死率均大于50％(图2c)。化合物9a-9c和10a在50 mg/L时对亚洲玉米螟的致死率大于50％，高于对照对照药剂除虫脲和灭幼脲。化合物9a-9b、10a-10b和10d-10e对小菜蛾表现出较高的抑制活性，在50 mg/L浓度下死亡率超过50%。其中，化合物10a对亚洲玉米螟和小菜蛾的LC50值分别为17.0 mg/L和8.8 mg/L，10a也是目前已报到的OfChi-h抑制剂中对亚洲玉米螟杀虫活性最好的化合物之一。这些化合物的酶抑制活性及杀虫活性数据反映出了先导结构优化策略的有效性。研究者选取代表性抑制剂9b、10a和10g进一步研究了化合物的抑制机理。首先进行了Dixon图分析，如图3a-c所示，化合物与靶酶的作用趋势线均在象限Ⅱ相交，表明化合物9b, 10a和10g是OfChi-h的竞争性抑制剂，其Ki值分别为23.2±1.8 nM，19.4±1.9 nM和43.2±4.5 nM。此外，利用荧光滴定实验确定了10a与OfChi-h之间的结合相互作用。如图3d所示，OfChi-h的荧光强度与化合物呈现浓度依赖，这证实了10a与OfChi-h活性口袋中的色氨酸残基之间存在相互作用。研究者之后通过分子对接研究阐述了化合物9b、10a和10g与OfChi-h的潜在相互结合方式。化合物9b与OfChi-h的结合模式表明其氨基嘧啶环位于活性口袋的-1亚位，与PHE309的苯环形成垂直π-π堆积相互作用，并与TYR383和ARG439形成氢键；其4-氯苯片段位于OfChi-h的+1亚位，与TRP268形成强π-π堆积相互作用；其4-氟苄基部分与MET381和ASP384形成两个氢键（图3e-f）。化合物10a和10g与OfChi-h的结合构象表明10a的4-氯苯基相对于10g发生了偏转，使其更加接近残基TYR383和TYR156，从而形成了更强的氢键作用力（图3g- h）。此外，10a和10g的氨基嘧啶可以与ARG439形成两个氢键，从而与OfChi-h的活性口袋紧密结合，其苄胺基团的苯环均与TYR268形成π-π相互作用。此外，10a可以通过氢键与TYR268结合，进一步增强了其结合作用力。基于上述结果，10a (Ki = 19.4 nM) 最终表现出了更高的抑制活性。同时研究者为了进一步验证10a与OfChi-h分子对接结合模式的稳定性，进行了30 ns的MD模拟。如图3i-j所示，10a与OfChi-h复合物体系的均方根偏差(RMSD)值保持在2.3 Å左右，并且在25 ns的模拟后实现了动态收敛。这表明化合物与OfChi-h的复合物体系经历了合理的构象变化，证实10a可以稳定地与OfChi-h结合。研究者进一步研究了具有高OfChi-h抑制活性的化合物10a和10g对亚洲玉米螟幼虫的影响。在预实验中，发现当使用100 μM浓度的10a和10g饲喂亚洲玉米螟幼虫时，大多数幼虫迅速变黑甚至死亡。因此，分别采用4 μM和10 μM浓度的10a和10g对亚洲玉米螟幼虫进行了饲喂实验。使用化合物10a和10g处理亚洲玉米螟幼虫6d后，观察到幼虫的相对体长和体重显著下降（图4a-c）。且幼虫出现卷曲、活动性降低、对外界刺激不敏感等现象，表明偶氮氨基嘧啶类化合物能显著抑制亚洲玉米螟幼虫的生长发育。为了进一步评估化合物对亚洲玉米螟幼虫表皮角质层的影响，进行了扫描电子显微镜（SEM）成像。其中，取食化合物10a和10g后的亚洲玉米螟幼虫角质层的形态变化如图4d所示，DMSO饲喂组（CK）亚洲玉米螟幼虫角质层表面光滑，无不规则的褶皱，背部角质层疏松，可见规则光滑的几丁质颗粒。抑制剂处理组的亚洲玉米螟幼虫背部角质层出现明显的形态变化，如明显的褶皱出现，几丁质颗粒更突出，尺寸更大，排列更紧密、更不规则。这些发现表明偶氮氨基嘧啶可以有效抑制角质层几丁质的水解，并且其酶抑制能力与其对几丁质蜕皮的抑制效果直接相关。这些实验也初步揭示了偶氮氨基嘧啶化合物的杀虫机理。研究者根据杀虫活性测定结果选定化合物10a进行盆栽试验。如图4e所示，化合物10a的防治效果优于除虫脲和灭幼脲。50 mg/L浓度的10a喷洒玉米叶片时，第7d对亚洲玉米螟的防治效果达到57%，与100 mg/L的除虫脲和氯虫脲相当。100 mg/L浓度下，第7d对亚洲玉米螟的防治效果为69%，明显高于对照除虫脲和灭幼脲。此外，10a处理玉米叶片7d后，亚洲玉米螟对玉米叶片的取食程度低于对照组。而Tween 80组玉米叶片受损情况非常严重，大部分叶片断裂(图4f)。这也是OfChi-h抑制剂在盆栽试验中对亚洲玉米螟防效的首次报道。这些结果揭示了偶氮氨基嘧啶化合物10a具有开发成为新型、有潜力、作用机制明确的杀虫剂。图4 化合物10a、10g对亚洲玉米螟幼虫的生长发育影响和化合物10a对亚洲玉米螟的盆栽防治效果对天敌安全性高是绿色农药的必备标准之一。玉米螟赤眼蜂是亚洲玉米螟的有效天敌，在亚洲玉米螟的生物防治中发挥着重要作用。研究者采用浸卵法和药膜法评价了化合物对玉米螟赤眼蜂的安全性(图5a)。结果表明，化合物9a-9c、10a和10g对玉米螟赤眼蜂的羽化和存活率没有影响，且毒性低于除虫脲。这也显示出几丁质酶Chi-h作为鳞翅目昆虫特有靶标的显著优势。研究者进一步预测了具有高杀虫活性的化合物对小鼠的口服毒性(LD50)，以进一步评估其作为杀虫剂的开发和利用潜力。发现化合物9b-9f和10a的口服LD50值大于5000 mg/kg(图5b)，显示出较高的安全性（根据美国环境保护署的农药毒性分类标准，LD50值大于5000 mg/kg的化合物被视为毒性较小）。这项研究报道了偶氮氨基嘧啶化合物可以作为一类新型、高效的昆虫几丁质酶抑制剂，并采用多维度评价策略验证了该类化合物的活性及安全性。其中，化合物10a对亚洲玉米螟几丁质酶OfChi-h的抑制常数 Ki 为 19.4 nM，对亚洲玉米螟的杀虫活性LC50为17.0 mg/L，是目前已报到的OfChi-h抑制剂中杀虫活性最好的化合物之一。此外，10a对亚洲玉米螟天敌赤眼蜂和哺乳动物也表现出高度安全性。因此，偶氮嘧啶类化合物10a可以作为一类新型、高效、安全的昆虫生长调节剂，具有较好的应用前景，并有望成为环保型绿色杀虫剂应用于农业实践。河北农业大学植物保护学院硕士研究生丁宝康和杨美玲、马树杰副教授为该论文的共同第一作者，我校董利利副教授、董金皋教授、张利辉教授为共同通讯作者。研究工作得到了国家自然科学基金、河北省重点研发计划等项目的资助。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14538Dong, L.L., Shen, S.S., Jiang, X., Liu, Y.X., Li, J.J., Chen, W., Wang, Y.Z., Shi, J.K., Liu, J.X., Ma, S.J., Zhang, L.H., Dong, J.G. and Yang, Q. (2022) Discovery of azo-aminopyrimidines as novel and potent chitinase OfChi-h inhibitors via structure-based virtual screening and rational lead optimization. J. Agric. Food. Chem. 70, 12203-12210.Hardardóttir, H.M., Male, R., Nilsen, F., Eichner, C., Dondrup, M. and Dalvin, S. (2019) Chitin synthesis and degradation in Lepeophtheirus salmonis: molecular characterization and gene expression profile during synthesis of a new exoskeleton. Comp. Biochem. Physiol. A: Mol. Integr. Physiol. 227, 123-133.Liu, T., Chen, L., Zhou, Y., Jiang, X., Duan, Y.W. and Yang, Q. (2017) Structure, catalysis, and inhibition of OfChi-h, the lepidoptera-exclusive insect chitinase. J. Biol. Chem. 292, 2080-2088.Rabadiya, D. and Behr, M. (2024) The biology of insect chitinases and their roles at chitinous cuticles. Insect Biochem. Mol. Biol. 165, 104071.Saguez, J., Dubois, F., Vincent, C., Laberche, J.C., Sangwan-Norreel, B.S. and Giordanengo, P. (2006) Differential aphicidal effects of chitinase inhibitors on the polyphagous homopteran Myzus persicale (Sulzer). Pest. Manag. Sci. 62, 1150-1154.Zhu, K.Y., Merzendorfer, H., Zhang, W.Q., Zhang, J.Z. and Muthukrishnan, S. (2016) Biosynthesis, turnover, and functions of chitin in insects. Annu. Rev. Entomol. 61, 177-196.为了不让您最关心的内容被湮没
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