骨关节炎（OA）作为影响老年人群的常见退行性关节疾病之一，OA主要病理特征包括软骨组织缺陷，其它关节成分病理改变等，导致患者生活质量下降。现代医疗尽管已经探索了许多药理学方法，并且一些药物在临床研究中已经显示出治疗前景，但是没有任何显著的临床成果，并且没有疾病改善疗法可以用于延迟或限制OA的发生发展，手术则存在高额的成本。因此发现新的药物干预手段对于OA的治疗具有巨大意义。
近日，武汉大学中南医院李景峰教授课题组在生物材料学领域著名杂志《Biomaterials》（IF=12.8）上发表题为“Molybdenum nanodots act as antioxidants for photothermal therapy osteoarthritis”的研究论文，该研究开发了钼纳米点（MND）作为仿生光热纳米材料，以模拟抗氧化合酶，从而保护软骨并促进软骨下骨再生，有望成为治疗OA的新利器。菲沙基因承担了研究中转录组测序及部分分析工作。
MND的设计与表征
MNDs是通过磷钼酸在碱性环境下与表儿茶素没食子酸酯还原反应，并添加化学制剂制备，其理化特性可以通过透射电镜、X射线、动态光散射、傅里叶变换红外光谱等表征，发现其光热转换效率为36.3%，表明其在光热疗法中的潜力。同时MNDs表现出了类似抗氧化酶的能力，通过SOD模拟、DPPH自由基清除等实验，验证了MNDs的抗氧化能力，并且通过实验也验证了其具有良好的生物相容性和光热稳定性。
综上所述，MNDs的设计与表征展示了其作为一种新型光热纳米材料在治疗骨关节炎中的潜力。MNDs的光热转换能力、ROS/RNS清除能力以及良好的生物相容性使其成为治疗骨关节炎的有前景的候选材料。
图1.MNDs的抗氧化能力
MNDs的生物相容性和其对ATDC5细胞的抗ROS作用
ATCD5细胞是小鼠软骨发生细胞系，研究评估了MNDs对ATCD5和骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞毒性，发现MNDs具有较低的细胞毒性，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，表明MNDS没有引起细胞膜损伤或细胞死亡，进一步通过显微镜观察，发现MNDs对细胞的生长和运动都没有负面影响。
通过检测细胞内ROS水平，发现MNDs可以有效降低ROS的积累，并且实验表明MND-NIR（近红外下MND）处理的细胞显示出较低的细胞凋亡率和炎性因子表达，如降低了p-P65的水平；通过评估细胞内ATP含量和线粒体膜电位，发现MND-NIR能恢复过氧化后ATDC5细胞的线粒体功能和能量代谢。
综上，研究表明MNDs不仅具有良好的生物相容性，并且可以在体外环境中为ATDC5细胞提供保护，抵御ROS的损伤，并且可以恢复细胞的正常功能。
图2.MNDs-NIR的生物相容性、保护作用和对ATDC5细胞中ROS的线粒体功能恢复作用
MNDs在NIR下对ATCD5细胞的保护作用
研究通过检测线粒体膜电位，发现MNDs和MNDs-NIR处理可以显著恢复ATDC5细胞的线粒体功能，提高线粒体膜电位；通过检测基因表达，发现MNDs-NIR处理可以显著降低由氧化引起的炎症反应，显著降低了炎症想关节炎的表达。并且MNDs-NIR处理促进了BMSCs的迁移和成骨形成，显著提高了成骨相关基因的表达。
通过细胞周期分析等方法，发现MNDs-NIR处理显著降低了ATCD5细胞的衰老标志物表达，减少了衰老细胞比例，降低了衰老相关基因的表达；MNDs-NIR处理可以显著提高软骨特异性蛋白的表达，促进软骨基质的生成，同时MNDs-NIR的处理降低了分解代谢相关基因的表达，抑制了软骨基质的降解；MNDs-NIR还可以通过调节抗氧化酶的表达和活性，恢复细胞的抗氧化能力，减少氧化应激引起的细胞损伤。
综上，MNDs在NIR下不仅能显著恢复ATDC5细胞的线粒体功能，抑制炎症反应，还能促进BMSCs的成骨分化。此外，MNDs-NIR处理还能有效抑制细胞衰老，恢复软骨细胞的功能，促进软骨基质的合成，抑制其降解。
图3. MNDs-NIR恢复细胞功能，发挥抗衰老作用，并刺激衰老ATDC 5细胞中的基质合成
RNA-seq分析MNDs-NIR对H2O2诱导的ATDC5细胞的影响
通过对H2O2诱导的ATDC5细胞进行RNA-seq测序，比较了MNDs-NIR处理与未处理的基因表达差异，发现了1807个差异表达基因（DEGs）。GO富集分析揭示了MNDs-NIR处理后上调基因主要集中在抗氧化过程、对ROS反应、氨基酸代谢等，表明MNDs-NIR激活了对抗氧化应激的生物过程，而下调基因集中在细胞衰老、炎症反应等，暗示MNDs-NIR可能通过调节这些过程来抑制炎症和细胞衰老。KEGG富集分析确定了MNDs-NIR处理后显著富集的关键信号通路，包括MAPK信号通路、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路以及细胞衰老相关通路。这些通路的富集表明MNDs-NIR可能通过调节这些信号通路来影响OA的进展。
通过差异分析进一步发现，MNDs-NIR能够增强热效应相关基因和软骨分化相关基因的表达，同时抑制炎症相关基因和衰老相关基因的表达。
综上，RNA测序分析表明，MNDs-NIR通过调节衰老、炎症反应和细胞功能，有效减少了ATDC5细胞内的ROS水平，抑制了细胞衰老，减轻了软骨炎症，并保护了软骨细胞的功能完整性。
图4. MNDs-NIR处理前后的ATDC 5细胞的RNA-seq
MNDs-NIR对OA的治疗效果
研究通过使用DMM手术诱导的OA小鼠模型来评估MNDs-NIR对OA的治疗效果。通过红外线热成像技术，发现注射MNDs后，结合NIR照射的小鼠膝关节温度明显升高。通过对小鼠膝关节组织切片染色，发现MNDs-NIR处理的小鼠显示出比对照组更好的软骨保护效果，软骨结构和组成更接近正常组。采用OARSI来量化软骨退化程度，发现MNDs-NIR处理的小鼠显示出显著降低的OARSI评分，表明该治疗策略能有效减轻软骨退化。通过评估滑膜炎症和使用微型计算机断层扫描，发现MNDs-NIR处理可以有效减轻炎症并促进软骨下骨再生；通过对生物标志物检测可以发现，MNDs-NIR处理显著提高了软骨基质合成标志物的表达，并降低了分解标志物的表达。
总而言之，MNDs-NIR展现出了对OA显著的治疗能力，可以有效改善OA小鼠的关节功能，减轻软骨退化、抑制炎症反应并促进软骨下骨的再生。
图5. MNDs-NIR在DMM诱导的OA小鼠中的治疗作用
进一步探究MNDs-NIR对OA的多方面功能，特别关注其对于线粒体功能障碍的恢复、抗炎和抗老化作用。通过对线粒体融合蛋白和线粒体分裂蛋白表达的检测，发现其可以改善线粒体功能并促进线粒体融合；并对关节内ROS水平和氧化损伤标记物检测，发现其可以降低ROS积累且具有抗氧化损伤的能力。对炎性因子和抗衰老相关标志物的检测发现，MNDs-NIR具有显著的抑制炎症的能力和有效抑制细胞衰老的能力。
综上，MNDs-NIR通过多种机制共同作用，包括改善线粒体功能、降低ROS水平、抑制炎症反应和延缓细胞衰老，从而有效缓解骨关节炎的进展。
图6. MNDs-NIR在体内表现出抗衰老和抗炎作用
MNDs-NIR的体内生物安全性评估
研究对MNDs-NIR对OA的生物安全性进行了全面的评估，对组织相容性、血液相容性、异位骨化和长期生物安全性进行了评估。结果表明MNDs在体内应用时显示出了良好的生物相容性和生物安全性，没有引起明显的组织损伤、血液系统异常或异位骨化。
本研究开发了一种基于MNDs的多功能纳米平台，用于光热疗法（PTT）治疗骨关节炎，基于此提出了一种新的治疗骨关节炎的方法-MNDs-NIR。通过调节线粒体功能和ROS水平，改善软骨和亚软骨下骨的再生能力，可以有效缓解OA的病情，且具有生物安全性，可以有效的效缓解症状，还可能从根本上逆转病情，为患者带来长期的生活质量改善。
湿实验结合生信分析的过程已经被应用的越来越广泛。本研究结合了大量体内体外实验证明了MNDs-NIR可以有效改善OA小鼠的关节功能和结构，并通过RNA-seq揭示了其潜在的分子机制，最后通过对其生物安全性的评估表明了其安全性。对比此前只有体内体外实验研究，RNA-seq为本次研究提供了相互验证并对后续机制挖掘都提供了有力的支持。
撰稿 | 张佳诚
审核 | 郭孟齐
