青藏高原是世界上最高的高寒地区，这里的家畜养殖面临着冬季饲料短缺的问题。青贮饲料的使用逐渐增加，但低温等环境条件限制了青贮发酵效果，且青贮饲料质量不稳定。垂穗披碱草（Elymus nutans）是青藏高原高寒草甸的本土草种，适应性强，是一种常用的饲料。因此，研究垂穗披碱草青贮过程中微生物群落的变化规律对于提高青贮质量具有重要意义。
近日，兰州大学生命科学学院李福厚/郭旭生团队在《Applied and Environmental Microbiology》期刊上在线发表了题为“Responses of microbial community composition and CAZymes encoding gene enrichment in ensiled Elymus nutans to altitudinal gradients in alpine region”的研究论文。该研究采用宏基因组测序技术，评估了青藏高原高寒地区垂穗披碱草青贮微生物群落组成及碳水化合物活性酶（CAZymes）编码基因富集对海拔梯度的响应。结果显示，随着海拔升高，青贮质量提高，有害细菌在发酵前期占主导，乳酸菌在后期逐渐成为主要微生物，且与碳水化合物代谢和有机酸产生相关的关键酶基因在高海拔青贮中更丰富。研究为了解不同海拔梯度对青藏高原青贮微生物组成和功能的影响提供了见解，并为提高青藏高原高海拔地区青贮发酵调控的可控性提供了参考方法。
菲沙基因在本研究中承担了宏基因组测序分析工作。
样本采集与青贮制备
选择青藏高原东部三个不同海拔（2600m低海拔、3600m中海拔、4600m高海拔）的地区，在垂穗披碱草抽穗期采集样本，每个海拔设置4个样地作为生物重复。将采集的垂穗披碱草切碎后，每个样地部分样本用于化学分析，其余分成16份，随机分配到4个青贮时期（7、14、30、60d），每个时期4个平行，装入真空密封聚乙烯塑料袋中进行青贮。
理化分析
在每个青贮时期，打开四个平行青贮袋，测定青贮饲料的发酵特性（pH和有机酸）和化学成分（包括干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、淀粉、水溶性碳水化合物等含量，以及有机酸浓度和干物质损失等）。
DNA 提取、文库构建与测序
取青贮样品，稀释后过滤，离心收集细菌沉淀，提取DNA。对提取的 DNA 进行质量控制和定量后，将每个样地在每个青贮时期的四个平行样本的DNA混合，构建文库，进行测序，对测序数据进行质量控制、分类学分析和功能注释。
测序策略：Illumina MGIseq 2000平台
发酵特性和化学成分
海拔和青贮天数对青贮pH值和乳酸浓度具有交互作用。与低、中海拔青贮相比，高海拔青贮的pH值7-30d显著降低，30和60d时高、中海拔青贮pH值最低且无差异，高、中海拔青贮的乳酸浓度高于低海拔青贮，60d时高、中海拔差异大。高海拔青贮的乙酸浓度最高。青贮前三个海拔的垂穗披碱草干物质含量相同，但青贮过程中高海拔青贮干物质含量下降，7d时高海拔青贮干物质损失最高，60d时低海拔青贮干物质损失最高，中海拔青贮最低。低、中海拔青贮的淀粉含量高于高海拔青贮，高海拔青贮的水溶性碳水化合物浓度高于低、中海拔青贮，且高海拔青贮的干物质和半纤维素含量低于低海拔青贮。（图1）
图1 青藏高原不同海拔青贮物发酵参数及化学成分
微生物群落组成
经过质量控制，保留了1248Gb的clean data用于分析。青贮发酵可分为早期（7 - 14d）和晚期（30 - 60d）两个阶段。早期，不论海拔高低，Hafnia，Serratia，Pantoea，Enterobacter，Enterococcus，Weissella和Rahnella是主要微生物；晚期，随着海拔升高，乳酸菌数量迅速增加，有害细菌减少。30和60d 时，低海拔青贮的优势细菌有Hafnia，Lactiplantibacillus， Enterobacter，Rahnella，Pantoea，Serratia，Pediococcus，Enterococcus和Lactococcus；中海拔青贮以Pediococcus、Serratia等为主；高海拔青贮的七个最丰富属为Lactiplantibacillus， Pediococcus，Hafnia，Serratia，Levilactobacillus，Leuconostoc和Latilactobacillus在高海拔青贮中最丰富，Pediococcus在中、高海拔青贮中比低海拔青贮更丰富，高海拔青贮晚期Levilactobacillus，Leuconostoc和Latilactobacillus的丰度增加。（图2）
图2 细菌序列的分类学分布
CAZymes基因富集和宿主鉴定
共对CAZymes对应的45,223个单基因进行了注释和分析。CAZymes由糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）、碳水化合物酯酶（CEs）、辅助活性（AAs）、碳水化合物结合模块（CBMs）和多糖裂解酶（PLs）组成，相对丰度按降序排列（图3A）。GH、GT和CE是最主要的CAZymes家族，占CAZymes总丰度的90%以上（图3B）。与L和M海拔青贮相比，在发酵30和60 d的H海拔青贮中检测到更高的GH丰度（P < 0.05；图3C）。而在青贮30d和60d，M和H海拔青贮饲料中的GT丰度均高于L海拔青贮饲料（P < 0.05）。在每个青贮期，CE的丰度随海拔高度的升高而呈增加趋势。GH和CE是参与碳水化合物降解的主要CAZymes，GH1和GH13在GH家族中丰度最高。早期青贮中GH基因的主要宿主是有害细菌，晚期以乳酸菌为主，且在中、高海拔青贮中丰度高。30d时，低海拔青贮中GH1主要由Lactiplantibacillus等多种菌携带，中海拔青贮中主要由Pediococcus等携带，高海拔青贮中主要由Lactiplantibacillus和Pediococcus携带。大量CE9和CE2基因在中、高海拔青贮中比低海拔青贮更丰富，CE9主要由Pediococcus携带，CE2主要由Lactiplantibacillus和Pediococcus携带。
图3 青藏高原不同海拔地区的青贮属植物中CAZym基因的丰度研究
微生物功能和糖代谢
KEGG分析揭示了与青贮发酵相关的高丰度酶和关键途径。KEGG参考途径中有大量单基因被注释，代谢是最丰富途径，其中碳水化合物代谢占比高且主要指青贮中糖厌氧分解为有机酸的过程。高海拔青贮30d时碳水化合物代谢相对丰度最高，60d时中、高海拔青贮的碳水化合物代谢比低海拔青贮更丰富。在25个最富集的KEGG途径中，12个参与碳水化合物代谢，糖酵解 / 糖异生和丙酮酸代谢是代表性途径。在糖酵解途径中，与糖酵解相关的关键酶在高（或中、高）海拔青贮14d后丰度最高，晚期以Lactiplantibacillus和Pediococcus等乳酸菌为主要宿主，一些其他菌属在不同海拔青贮中也作为载体。在TCA循环中，相关酶主要富集在有害细菌中，随着海拔升高和青贮时间延长，其丰度逐渐降低，表明丙酮酸代谢通过TCA循环的能力逐渐下降。在丙酮酸代谢中，与乳酸和乙酸生产相关的酶丰度从14d起随海拔升高而增加，高海拔青贮最高，晚期以Lactiplantibacillus和Pediococcus等乳酸菌为主要宿主，同时一些其他菌属在不同海拔青贮中也作为宿主；与乙醇生产相关的酶主要在有害细菌中（图4和图5）。
图4 糖酵解/糖异生途径的热图谱
图5 青贮发酵过程中碳水化合物水解、葡萄糖代谢、乳酸和乙酸生产的功能模型
了解海拔梯度对青贮微生物组的影响
研究发现青藏高原地区垂穗披碱草青贮发酵品质随着海拔升高而变好。揭示了在发酵后期，携带碳水化合物活性酶基因和与有机酸生产相关的关键酶基因的宿主丰度随着海拔升高而增加。
确定核心微生物
确定了乳酸杆菌属（Lactiplantibacillus）和片球菌属（Pediococcus）是青贮后期负责多糖水解和青贮发酵的核心微生物。
指导青贮生产
为了解青藏高原不同海拔对青贮微生物组成和功能的变化提供了见解。
为提高青藏高原高海拔地区青贮发酵品质的可控性提供了参考方法。
青贮饲料的发酵品质主要取决于微生物群落及其在青贮过程中的演替，了解微生物群落动态和功能对调控青贮发酵过程和改善其发酵品质具有重要意义。近年来研究发现，高通量微生物群落测序在微生物功能基因预测上存在一定局限性，而宏基因组分析可更全面地揭示微生物群落的分类和功能基因组成。
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