导读
组蛋白乙酰化是一种重要的表观遗传修饰，它调控基因表达、应激反应中的染色质变化以及细胞命运的转变。荧光共振能量转移（FRET）生物传感器已被开发用于各种表观遗传事件，以便能够时空追踪亚细胞信号事件。先前报道的识别两个乙酰化残基的组蛋白 H3 乙酰化生物传感器缺乏特异性。在这项研究中，我们利用 BRD4 的单个溴结构域，开发了一种基因编码的 H3K9ac 生物传感器。我们系统地研究了 BET 家族蛋白作为结合域的不同组合，并进行了位点饱和突变以优化该生物传感器，在曲古抑菌素 A（TSA）处理下实现了高达 30% 的动态 FRET 变化。通过应用优化后的 H3K9ac 生物传感器，我们揭示了与良性肿瘤细胞相比，侵袭性肿瘤细胞中不同的基础活性染色质结构。此外，我们发现当癌细胞通过微通道时，H3K9ac 水平急剧增加，这模拟了癌细胞在体内穿过狭窄空间时所遇到的物理限制和机械微环境条件。这一结果突显了染色质在应对外部机械应力时的可塑性。总之，我们的 H3K9ac 生物传感器为癌症中细胞命运转变的机制研究以及机械转导提供了一种多功能工具。
图文摘要
01. 结果
图1. H3K9 乙酰化生物传感器。A. H3K9 和 H3K14 双乙酰化生物传感器的组成示意图及激活机制；B 和 C. 在一个表达 H3K9ac 生物传感器的典型 HEK293T 细胞中，标准化 FRET / 增强型青色荧光蛋白（ECFP）比值的时间进程以及伪彩色图像。色标条代表发射比值的范围，冷色和暖色分别表示低水平和高水平的 H3K9ac。比例尺，10 微米；D 和 E. 用二甲基亚砜（DMSO）或 1 微摩尔曲古抑菌素 A（TSA）处理 6 小时的 HEK293T 细胞中突变型生物传感器的 FRET 比值定量分析及代表性图像。H3K9R、H3K14R 以及 K9RK14R 双突变生物传感器发生了突变，使得组蛋白上的原始残基不再能被乙酰化，从而消除了 FRET 信号。BD2Y390F 突变体在 BD2 结合配体上的残基发生突变，消除了 BD2 结构域与 H3K14ac 的结合能力。所有组别的样本数量 n＞22。比例尺，10 微米。采用单因素方差分析及校正后的多重 t 检验来计算统计学显著性。
02. 监督学习
图2. 用于乙酰化组蛋白结合的不同类型溴结构域。A. 10 种乙酰化生物传感器的示意图；B. 在经二甲基亚砜（DMSO，对照）或 1 微摩尔曲古抑菌素 A（TSA）处理 6 小时的 HEK293T 细胞中，5 种具有不同溴结构域的乙酰化 FRET 生物传感器的 FRET 比值定量分析。采用单因素方差分析及多重 t 检验校正来计算统计学显著性。***：p < 0.0001；：p < 0.05；C - G. 具有不同溴结构域配置的不同生物传感器之间的 FRET 比值定量分析。统计学显著性与 B 相同；H. 来自（B - G）中 7 组显示显著 FRET 变化的代表性 FRET 比值图像。
图3. BRD4BD1 - YPet 生物传感器显示出高动态范围。A. 由BioRender.com创建的 BRD4BD1 - YPet 单溴结构域 H3K9ac 生物传感器的组成示意图及激活机制；B. 表达组蛋白 H3 乙酰化探针的 HEK293T 细胞核中 FRET/ECFP 比值的伪彩色图像，左图：对照组；右图：经 1μM 曲古抑菌素 A（TSA）处理 6 小时。显示范围：0.7 - 1.3；C. 平均 FRET/ECFP 比值柱状图，样本数量分别为 n = 99 和 83，采用无方差齐性假设的 t 检验，p ≤ 0.01；D. 在 HEK293T 细胞中，经 1µM TSA 处理及洗脱后 FRET 比值随时间变化的图像；E. 表达 BRD4BD1 - YPet 生物传感器的 HEK293T 细胞核在经 1µM TSA 或二甲基亚砜（DMSO）处理 10 小时后的代表性伪彩色图像；F. 相应的平均定量；G、H. 上述细胞核中 FRET/ECFP 比值的个体定量。
图4. 计算生物学优化以分析 BRD4 蛋白结构及三重突变生物传感器的特性。A. BRD4 (BD1) - H3 复合物的结构模型。以 BD2 与 rel 肽的复合物为模板（蛋白质数据库编号：4kv4），将 H3 肽的同源模型插入 BD1 的晶体结构（蛋白质数据库编号：6FO5）。使用 Forcefield 网络服务器对 H3K9 进行乙酰化。在 NVT 条件下，利用 OpenMM 中实现的分子动力学算法，采用 Amber 力场（ff03）对所得的 BD1 - H3K9ac 复合物总共模拟一微秒。从分子动力学轨迹中提取出 BD1 - H3 复合物的代表性构象（左列）并提取代表性构象异构体。BD1 的表面根据一种优化指标上色，该指标考虑了与 H3 肽结合界面的接近程度以及分子间相互作用。得分为 1 表示该氨基酸不参与 BD1 与 H3 之间任何稳固的分子间相互作用，且该残基靠近结合界面，而得分为 0 表示该残基远离结合界面或在整个分子动力学模拟过程中参与稳定的分子间相互作用；B. BRD4 (BD1) 直系同源物的序列标识。由于位置 84、85 和 143 的得分较为有利，因此被选为可优化位置。因为在一些直系同源物的位置 85 处出现正电荷，我们尝试在位置 84 - 85 引入正电荷（Q84K、Q85R）。同样，由于在一些直系同源物的位置 143 处出现负电荷，我们在位置 143 引入负电荷（G143D）；C. 使用金门组装法进行位点饱和突变的示意图。由BioRender.com创建；D. 用野生型（WT）或突变型生物传感器转染的 HEK293T 细胞中 YPet、ECFP 和 FRET 信号的定位。比例尺：10 µm；E. 在 1 µM 曲古抑菌素 A（TSA）处理 8 小时期间，野生型或突变型生物传感器的 FRET/ECFP 比值定量分析；F. 野生型与三重突变生物传感器之间的定量比较；G. 野生型与三重突变生物传感器之间 FRET/ECFP 比值的百分比变化。该比值通过终点处的 FRET/ECFP 比值除以起始处的比值计算得出。经学生 t 检验，p < 0.05；H. 与 H3 肽结合的 BRD4 (BD1) 异构体的结构模型。利用我们从分子动力学得到的 BD1 - H3 复合物模型，我们比较野生型 BD 与 BD1 突变体（Q84K、85R、G143D）的表面性质。在 UCSF Chimera 中使用 Drunback 旋转异构体库进行突变。BD1 异构体表面的库仑表面（上排）从红色（- 10 kcal/mol/e）到蓝色（+ 10 kcal/mol/e）上色，我们突变的 BD1 表面（下排）为橙色。
图5. 34 - mer 生物传感器在各种癌细胞系中的研究。A. 由 BioRender.com 创建的 34 - mer 生物传感器示意图，为直观了解该传感器的结构布局提供可视化展示，有助于后续对其功能机制的探讨；B. 经 1 μM 曲古抑菌素 A（TSA）/ 二甲基亚砜（DMSO）处理 6 小时后，转染了 H3K9ac - 34mer FRET 生物传感器的 HeLa 细胞的代表性图像，比例尺为 10 µm，通过图像可初步观察细胞在处理后的形态及传感器相关表现；C. 对经 TSA/DMSO 处理的 HeLa 细胞中 FRET/CFP 比值的定量分析（基于 B 中的数据；样本数量 n > 50），以量化数据精准反映处理因素对细胞内该比值的影响，为深入研究提供确切依据；D. 转染了 H3K9ac - 34mer 生物传感器的 HeLa、MCF - 7 和 MDA - MB - 231 细胞的代表性 FRET 图像，比例尺 10 μm，对比不同癌细胞系中的图像，可探究传感器在多种细胞环境下的表现差异；E. 对（H）中 FRET/CFP 比值的定量分析，进一步挖掘实验数据背后的信息，明确不同条件下该比值变化规律；F. HeLa、MCF - 7 和 MDA - MB - 231 细胞中 H3K9ac 水平的蛋白质免疫印迹（Western blot）图像，直观呈现不同癌细胞系中该蛋白的表达情况；G. 对（F）中相对 H3K9ac 水平的定量分析，结合统计学方法，即通过单因素方差分析和 Turkey 多重比较检验计算显著性，精准判断不同细胞系间该蛋白水平差异是否具有统计学意义；H. 经 1 μM TSA/DMSO 处理 6 小时后，转染了 H3K9ac - 34mer 野生型（WT）、H3K14A、H3K9A FRET 生物传感器的 HeLa 细胞的代表性图像，比例尺 10 µm，为后续对比突变型与野生型传感器在细胞内的表现差异提供直观资料；I. 对转染了突变型生物传感器并经 TSA/DMSO 处理的 HeLa 细胞中 FRET/CFP 比值的定量分析（基于 h 中的数据；样本数量 n > 50），通过量化数据评估突变对传感器性能的影响，助力优化传感器设计。
图6. 微流控腔室挤压改变 H3K9ac 水平。A. 微流控腔室设计图示，清晰呈现其结构构造，为理解后续细胞实验环境搭建提供基础；B. 活 HeLa 细胞通过 5 μm 孔径时的代表性时间序列 FRET 图像，比例尺 10 μm，借此可动态观测细胞在微流控环境下的相关变化；C. HeLa 细胞在通过 5 μm 孔径的不同时间点的相对 FRET/ECFP 比值（基于 B 中的细胞），以量化数据反映细胞在微流控挤压过程中的实时变化；D. 转导野生型 H3K9ac 生物传感器的 HeLa 细胞在通过 5 μm 孔径前后的 FRET/CFP 比值定量分析，通过双尾配对 t 检验确定显著性，精准判断微流控挤压操作对细胞内该比值的影响。
本文亮点
一种带有单个溴结构域的基因编码的 H3K9ac 荧光共振能量转移（FRET）生物传感器被开发用于活细胞成像。
与侵袭性较弱的肿瘤细胞相比，新型生物传感器检测到高侵袭性肿瘤细胞中不同的基础 H3K9ac 水平。
当癌细胞受到外部机械应力时，乙酰化水平会升高。
作者：赵月棠
审核：方 俊
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https://link.springer.com/article/10.1007/s44258-024-00032-4
引用格式
Li, S., Sun, C., Harrison, R.E.S. et al. Engineering FRET biosensor for H3K9 acetylation imaging in single living cells. Med-X 2, 26 (2024). https://doi.org/10.1007/s44258-024-00032-4
作者简介
李石天，现为加州大学圣地亚哥分校(UCSD)生物科学学院和索尔克(Salk)生物研究所联合培养博士生，研究方向为癌症免疫学和表观遗传学。本科期间，他在王英晓教授实验室参与开发组蛋白H3乙酰化FRET传感器。他以优异成绩获得UCSD生物工程与数学双学士学位，并曾在赵静教授实验室担任研究助理。
孙畅，现为巴塞罗那大学IDIBELL研究所和深圳湾实验室联合培养博士生，专业方向为癌症细胞与分子学。在读期间，参与组蛋白H3乙酰化FRET传感器的开发与优化，并发现组蛋白乙酰化与外界机械力之间的联系。
刘龙伟，现任南加州大学阿尔弗雷德·曼恩生物医学工程系研究助理教授，专注于免疫工程和活细胞成像的分子传感器开发。他通过定向进化基因编码的生物传感器，以高时空分辨率研究细胞内信号传导，并在Nature Materials、PNAS、Nature Communications等高影响力期刊发表多篇论文。他曾获得 NIH K01奖和清华大学优秀博士论文奖等多项荣誉，致力于推动基因与分子活动可视化领域的发展。
王英晓，师从钱煦院士和诺贝尔奖得主钱永健院士，现任南加州大学阿尔弗雷德·曼恩生物医学工程系教授及系主任，同时兼任分子微生物学与免疫学教授。他专注于开发基因编码的生物传感器和分子转换器，并用于活细胞和动物活体中分子事件的高时空分辨率成像，致力于工程化免疫细胞，实现远程、非侵入性的癌症免疫治疗。他是美国医学与生物工程院、国际医学与生物工程院及生物医学工程学会成员，并获得多项科研资助和奖项，为细胞与分子工程领域做出了重要贡献。
彭琴，现任职深圳湾实验室系统与物理生物学研究所特聘研究员。致力于研究细胞核力学调控的遗传学与表观遗传学，开发基于FRET的一系列力-表观遗传探针，研究机械信号如何影响染色质可及性和基因表达。她在多个顶级学术期刊如Nature Communications、Science Advances、PNAS等发表论文，并多次在国际会议上分享研究成果。自2020年加入深圳湾实验室以来，彭琴团队开发了多种活细胞探针，包括实现活细胞内单个基因位点的示踪标记和操控的SIMBA系统，m6A修饰的mRNA的活细胞探针SMIS以及Lamin A的磷酸化探针LAPS，推动了活细胞成像和表观遗传学领域的前沿发展。
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Med-X 期刊发文聚焦生物医学工程领域，包括但不限于以下10个前沿专题：分子与细胞工程，生物材料与组织工程，药物、基因和细胞输送系统，免疫工程，生物力学与机械生物学，生物热科学与工程，生物医学仪器与生物传感器，医学机器人、人工智能和远程医疗，生物医学影像学，生物信息学和计算生物学等。
