导读
牙周炎（periodontitis）是一种由微生物引起的慢性口腔炎症疾病，全球成年人口中有约50%的人患有不同程度的牙周炎。牙周炎患者通常表现为牙龈出血、牙齿松动等症状，给广大患者的生活和健康带来了严重的困扰。健康人的口腔微生物群通常与宿主处于稳态，然而这种平衡被打破时，往往会导致口腔致病菌过度滋生，进而诱发炎症和破坏牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）。临床上治疗牙周炎的常规抗生素（如四环素类）可以有效抑制牙周病原菌的生长，但不具有免疫调节特性。
该研究发现抗生素药物—阿奇霉素（AZM）是一种兼具抑制细菌生长和调控炎症作用的双功能药物。为了实现牙周炎的局部无痛微创治疗，研究进一步设计了一种新型的载有AZM微颗粒（AZM MP）的可溶解性微针贴片递送系统。体外实验结果显示负载AZM微颗粒的微针贴片对牙周细菌Aa和牙龈卟啉单胞菌具有很强的抗菌特性，同时用其处理小鼠骨髓来源巨噬细胞 (BMDM)及人外周血单核细胞 (PBMC)，可以显著降低炎性细胞因子的表达、增加抗炎细胞因子的表达及向抗炎M2型巨噬细胞极化的能力。研究还采用大鼠牙周病模型验证了所开发的治疗性微针贴片可以在体内显著抑制细菌生长、降低炎症反应、并诱导伤口快速愈合和牙槽骨再生。另外，研究还发现添加免疫调节剂 IL-4 MP的AZM&IL-4联合治疗微针贴片可以进一步增强其疗效。本研究为治疗牙周炎等炎症性疾病提供了一个全新的无痛微创治疗方案，具有很强的临床转化应用潜力。
图文摘要
01. 双功能小分子的筛选
图1. 小分子筛选对巨噬细胞极化的影响。a. 通过qPCR检测四种选定的免疫调节小分子（“AZM”=阿奇霉素，“Tof.”=托法替布，“Lup.”=鲁帕醇和“Dex.”=地塞米松）对小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中iNOS表达的影响。所有数据以平均值±标准差（n=3）表示；b. 通过琼脂平板上的抑菌圈测量这些化合物对口腔细菌A.a.的抗菌特性。红线表示抑菌圈的半径；c和d通过流式细胞术测量大鼠骨髓来源的初级巨噬细胞（BMDMs）中CD86+ M1型巨噬细胞和CD163+ M2型巨噬细胞的百分比。对于MCSF组，巨噬细胞在巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）中生长；LPS组用脂多糖（LPS）刺激6小时；并分析了在LPS刺激6小时后，两种抗生素——AZM（阿奇霉素）和TTC（四环素）的处理效果。n=3
02.AZM-MN贴片的设计与表征
图2. PVP微针的物理表征。a. 显示加载有可生物降解PLGA微粒（MPs）的可溶性PVP微针（MN）设计的示意图；b. 微针的施用、溶解和药物释放的示意图；c. AZM微粒的代表性明场图像，比例尺为50微米；d. 通过单乳化和双乳化方法制备的AZM和IL-4微粒的粒径分布，所有数据以平均值±标准差（n=4）表示；e. 在37°C和pH 7.4条件下AZM和IL-4微粒的体外累积释放；f. 载有微粒的微针的扫描电子显微镜（SEM）图像，比例尺为200微米；g, h. 微粒在针尖和基底部分布的荧光图像，比例尺为200微米；i. 使用Instron机器测量的微针的机械强度，所有数据以平均值±标准差（n=4）表示；j. 载有FITC-地塞米松PLGA微粒的微针穿透新鲜大鼠牙龈组织的图像，比例尺为200微米。
03. 微针贴片的体外评估
图3. 微针在体外释放阿奇霉素表现出抗生素和免疫调节作用。a, b 从微针释放30天的上清液对P. gingivalis进行测试。通过菌落形成单位（CFU）（a中）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）吸光度570 nm（b中）测量细菌生长和活力；c, d 对加载AZM微粒的微针对P. gingivalis和A.a.细菌进行Kirby扩散试验；e 测量用各种配方处理的人PBMCs的增殖情况。PBMCs用ConA和LPS刺激3天。数据以标准化值表示（未处理PBMC组的百分比）；f, g 通过ELISA测量炎症细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达。所有数据以平均值±标准差（n=4）表示。统计显著性以p < 0.05，p < 0.01和p < 0.001表示不同配方样品之间的差异。
04. 用于牙周治疗的微针贴片的体内评估
图4. 在大鼠牙周炎模型中对微针贴片的体内评估。采用结扎引发的牙周疾病模型。a. 疾病诱导、治疗和样本采集的示意时间表。简要说明：将结扎线接种A.a.并绑在第二磨牙上三周。结扎线被移除后，通过切口将微针贴片放置在附近的牙龈上。每两周收集一次唾液，并在八周时收集周围的牙龈组织和牙槽骨以进行进一步分析；b. 牙周组织中A.a.细菌16S核糖体DNA的PCR分析，以腭组织重量标准化；c-e. 通过定量PCR分析牙周组织中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达。mRNA表达水平通过2.−ΔΔCt方法相对于β-actin进行标准化；f. 通过ELISA分析每两周测量一次唾液中的IL-1β蛋白水平，持续八周；g. 通过ELISA每两周测量一次唾液中的TNF-α蛋白水平，持续八周。健康组：健康的大鼠；未处理组：未处理的牙周炎；空白组：不含任何治疗药物的微针贴片；AZM组：含阿奇霉素PLGA微粒（阿奇霉素，1毫克/贴片）的微针贴片；AZM + IL-4组：含IL-4 PLGA微粒（IL-4，40纳克/贴片）的微针贴片；AZM + IL-4组：含有阿奇霉素和IL-4 PLGA微粒（阿奇霉素，1毫克；IL-4，40纳克/贴片）的微针贴片。数据以平均值±标准差（n=5）表示。使用单因素方差分析及事后分析进行结果分析。统计显著性由星号表示：*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001和p < 0.0001。
图5. 体内评估抗炎标志物和巨噬细胞极化状态。采用结扎引发的牙周疾病大鼠模型；a. 抗炎细胞因子IL-10的相对mRNA表达水平；b. Treg标志物FOXP3的相对mRNA表达水平；c. 从采集的组织中免疫染色的CD206+巨噬细胞。数据使用Fiji软件量化，并以平均值±标准差（n=5）表示。比例尺为20微米。结果通过单因素方差分析及事后分析进行分析。统计显著性由星号表示：*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001和p < 0.0001。白色箭头指示CD206+细胞的例子。
图6. 体内组织愈合和骨再生的评估。在结扎引发的牙周疾病大鼠模型中，(a-d) 牙周组织中促愈合基因RUNX2、COL1A1、BMP-2和OCN的相对mRNA表达水平；e. MN植入8周后的大鼠上颚microCT图像。所有标本都进行了标准化，并对microCT图像进行了校准，以便进行定量比较。虚线表示骨脊与CEJ之间的距离；f. 通过测量骨脊与CEJ之间的距离，定量分析8周治疗后的垂直骨恢复情况；g. 使用MN植入后8周的3D重建体积计算相对体积骨恢复。所有数据以平均值±标准差（n=5）表示。结果通过单因素方差分析及事后分析进行分析。统计显著性由星号表示：*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001和p < 0.0001。
发现单一化合物（阿奇霉素）兼具抗生素和免疫调节作用的双重功效，可以抑制细菌生长和炎症反应，并促进组织再生。
快速溶解性微针贴片能够实现载药微颗粒的无创局部输送，并在损伤组织中实验治疗药物的持续可控释放。
作者：赵月棠
审核：方 俊
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https://link.springer.com/article/10.1007/s44258-024-00023-5
引用格式
Zhang, X., Hasani-Sadrabadi, M.M., Dashtimighadam, E. et al. Dissolvable microneedle patch enables local delivery of immunomodulatory microparticles containing bifunctional molecules for periodontal tissue regeneration. Med-X 2, 11 (2024). https://doi.org/10.1007/s44258-024-00023-5
作者简介
张雪翔（Xuexiang Zhang），加州大学洛杉矶分校生物工程专业博士（导师 李松教授），美国康奈尔大学获得化学与分子生物工程专业的本科和硕士学位。博士期间主要研究方向是免疫工程和药物递送。2023年博士毕业后，加入Baruch S. Blumberg研究所，专注于早期药物研发，在研究病毒、药物和人体免疫的相互作用，对免疫系统及免疫治疗具有浓厚兴趣。
李松（Song Li），加州大学洛杉矶分校生物工程系教授，加州生物工程研究所主任，Med-X期刊共同主编，并担任美国医学与生物工程院董事会成员。李教授的研究领域为细胞和组织工程，对生物物理因素如何调节干细胞分化和细胞重编程的理解做出了重要贡献，开发了用于组织再生和疾病治疗的生物材料、干细胞和免疫细胞工程的多学科方法。他在Nature Materials，Nature Biomedical Engineering 等顶级科学期刊上发表200多篇论文，已申请19项专利，合编专著3本。他在生物工程领域获得了许多奖项和荣誉，包括中国生物材料学会颁发的全球生物材料领导奖，并当选为美国医学与生物工程院、美国生物医学工程学会和国际医学与生物工程科学院会士。
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Med-X 期刊发文聚焦生物医学工程领域，包括但不限于以下10个前沿专题：分子与细胞工程，生物材料与组织工程，药物、基因和细胞输送系统，免疫工程，生物力学与机械生物学，生物热科学与工程，生物医学仪器与生物传感器，医学机器人、人工智能和远程医疗，生物医学影像学，生物信息学和计算生物学等。
