导读
循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤脱落并进入患者体液的癌细胞，它们会转移至远处部位，最终形成转移灶。了解循环肿瘤细胞的生物学特性，尤其是其转移过程中的关键阶段，有望实现更好的癌症治疗效果。自本世纪初以来，液体活检因其无创特性已逐渐成为一个热门研究领域。作为最具前景的肿瘤生物标志物之一，循环肿瘤细胞在癌症诊断、预后、治疗反应监测以及生物机制探究方面展现出了巨大潜力。尽管各类分离和检测技术不断涌现，但循环肿瘤细胞的稀有性和异质性仍然给这些方法带来了巨大挑战，导致其效率低下。此外，不同技术的临床应用仍缺乏合理且统一的标准。本综述详细概述了循环肿瘤细胞的分离和富集策略及其优势与局限性。通过总结现状并对循环肿瘤细胞未来的研究方向提出建议，希望各方能继续齐心协力推动循环肿瘤细胞的临床应用，这或许会代表未来癌症诊疗的范式转变。
图文摘要
01. 基于生物学的分离技术
图1. 磁性富集（基于抗体的）循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. MagSweeper™。一种磁棒，它能够捕获标记有磁珠的循环肿瘤细胞，在清洗站去除其他不需要的细胞，并在释放孔中释放循环肿瘤细胞；B. 免疫磁小体 。一种用白细胞膜和抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体修饰的磁性纳米簇。版权归 2016 年约翰威立父子出版公司所有；C. 中性粒细胞膜包裹的免疫磁性纳米颗粒。用中性粒细胞膜进行功能化的免疫磁性纳米颗粒，旨在提高循环肿瘤细胞分离的捕获效率和纯度。
图2. 磁性富集（基于核酸适配体的）循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 纳米章鱼。一种将长的核酸适配体 DNA 链固定在磁性微粒上，并通过模拟章鱼结构靶向蛋白酪氨酸激酶 7（PTK7）受体的技术；B. 双面胶带。一种使循环肿瘤细胞间接与带有多拷贝核酸适配体的配体 - 磁性纳米颗粒（MNPs）相互作用的 DNA 装置；C. HM-Fe₃O₄@SiO₂/ 四链 DNA-Ag₂S 。一种纳米平台，它结合了靶向黏蛋白 1（MUC1）的近红外（NIR）多价核酸适配体、功能化的 Ag₂S 纳米点以及杂化细胞膜包覆的磁性纳米颗粒（MNPs）；D. CoFe₂O₄@Ag 磁性纳米杂化物。一种整合了经 HB5 核酸适配体修饰的 CoFe₂O₄@Ag 磁性纳米杂化物与二维过渡金属碳化物、氮化物或碳氮化物（MXenes）来分离和检测循环肿瘤细胞的装置。
图3.纳米结构基底（基于抗体的）循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 三维硅纳米柱阵列。一种涂覆有抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体的纳米结构基底；B. 二氧化钛（TiO₂）纳米纤维基底。一个将静电纺丝制备的二氧化钛纳米纤维（TiNFs）沉积基底与抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体相结合的纳米结构平台；C. 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米纤维 - 纳米魔术贴芯片 。一种将纳米魔术贴芯片与阿克图尔斯 XT 激光捕获显微切割（LCM）技术相结合，用于捕获、检测及分离单个循环肿瘤细胞的装置；D. 分形金纳米结构。一种能够高效捕获和释放循环肿瘤细胞的纳米结构基底。
图4. 纳米结构基底（基于核酸适配体的）循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 壳聚糖。一种通过电喷雾制备的纳米颗粒表面，用于特异性捕获罕见的循环肿瘤细胞；B. 牛血清白蛋白 - 二氧化钛（BSA-TiO₂）纳米棒阵列。一种用牛血清白蛋白（BSA）和靶向上皮细胞黏附分子（EpCAM）的 DNA 核酸适配体修饰的纳米棒阵列；C. 金纳米线阵列。一种以阳极氧化铝（AAO）为模板，通过电化学沉积法用核酸适配体 - sgc8c、聚乙二醇（PEG）和牛血清白蛋白（BSA）进行修饰的阵列。
图5. 微流控技术（基于磁性富集的）循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. IsoFlux™系统。一种将微流控技术与磁性富集方法相结合，在隔离区分离循环肿瘤细胞的系统；B. 磁性分级流式细胞术。一种通过整合微流控技术与 X 形微磁体，能够产生高磁场梯度，并依据循环肿瘤细胞特定表面标志物（如上皮细胞黏附分子 EpCAM）的表达情况来捕获它们的装置。
图6. 微流控技术（基于纳米结构基底的）循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 循环肿瘤细胞芯片（CTC-chip）。一种微流控平台，能够在精确控制的层流条件下，利用涂覆抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）的微柱从血液样本中分离出许多有活性的循环肿瘤细胞。B. 人字形芯片（Herringbone-chip）。一种高通量微流控混合装置，利用微涡旋和表面脊来扰乱血流流线，增加循环肿瘤细胞与涂覆 EpCAM 的壁面之间的碰撞；C. 纳米颗粒人字形芯片（Nanoparticle Herringbone-chip）。一种芯片，它利用化学配体交换反应来释放附着在与人字形芯片（HB-Chip）结合的金纳米颗粒涂层上的细胞；D. 硅纳米柱平台（Silicon Nanopillar Platform）。一种循环肿瘤细胞捕获平台，将涂覆抗 EpCAM 的硅纳米颗粒（SiNP）基底与覆盖其上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控混沌混合器整合在一起；E. 几何增强混合芯片（Geometrically Enhanced Mixing Chip）。一种基于几何优化微混合器结构的芯片，通过横向流和流折叠来增强循环肿瘤细胞与抗 EpCAM 基底之间的相互作用；F. 硅纳米线基底（Silicon Nanowire Substrate）。一种用通过细胞指数富集配体系统进化技术（cell-SELEX）设计的合理核酸适配体混合物进行修饰的微流控芯片。
图7. 细胞系、白细胞（WBCs）和患者循环肿瘤细胞（CTCs）之间大小及上皮细胞黏附分子（EpCAM）表达情况的比较。A. 通过整体式芯片获取的白细胞、癌细胞系（包括黑色素瘤细胞系（SK-Mel28）、肺癌细胞系（H1975）、前列腺癌细胞系（PC3-9）以及乳腺癌细胞系（MB231 和 SkBR））以及四种癌症类型的循环肿瘤细胞的大小分布情况。只有 0.1% 的白细胞其大小超过了 13.9 微米处的水平线；B. 源自四种癌症类型患者的循环肿瘤细胞的大小分布情况；C. 白细胞、癌细胞系（包括黑色素瘤细胞系（SK-Mel28）、肺癌细胞系（H1975）、前列腺癌细胞系（PC3-9）以及乳腺癌细胞系（MB231 和 SkBR））以及四种癌症类型的循环肿瘤细胞的上皮细胞黏附分子（EpCAM）表达分布情况。147 任意单位（a.u.）处的水平线表示预估的 CellSearch® 捕获阈值；D. 源自四种癌症类型患者的循环肿瘤细胞的上皮细胞黏附分子（EpCAM）表达分布情况。（E）乳腺癌、（F）肺癌以及（G）前列腺癌患者体内单个循环肿瘤细胞和白细胞的上皮细胞黏附分子（EpCAM）表达及大小的比较分布情况。注：水平和垂直的点划线及虚线分别被定义为大小 13.9 微米以及上皮细胞黏附分子（EpCAM）表达量为 147 任意单位（a.u.）。
02. 基于物理原理的分离技术
图8. 基于过滤的循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. ScreenCell®。一种利用带有直径为 7.5 ± 0.36 微米或 6.5 ± 0.33 微米圆形孔隙的过滤器分别分离固定细胞或活细胞的系统；B. Parsortix™。一个将微流控技术与阶梯式物理结构相结合，以高捕获效率分离循环肿瘤细胞的微流控平台；C. 流体辅助分离技术。一种利用快速（FAST）技术以及孔径为 8 微米的径迹蚀刻聚碳酸酯膜从全血中分离循环肿瘤细胞的系统；D. 月牙形捕获器。一个带有三个 5 微米间隙，用于从全血中分离循环肿瘤细胞的平台，其实现了良好的分离效率；E. 微腔阵列。一种圆形尺寸选择性装置，其直径为 9 微米，在循环肿瘤细胞分离方面实现了高捕获效率（超过 80%）、高细胞活性（98%）以及快速（200 - 1000 微升 / 分钟）的分离速度；F. 可分离双层结构。一种上层孔径为 40 微米、下层孔径为 8 微米，基于尺寸进行循环肿瘤细胞捕获的微滤器。
图9.基于确定性侧向位移的循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 确定性侧向位移微流控装置。一种利用确定性侧向位移（DLD）阵列将循环肿瘤细胞与其他背景细胞进行分离的微流控装置，具有高捕获效率、高通量以及高细胞活性的特点；B. 微流控棘轮机制装置 。一种带有锥形微米级收缩结构和振荡流的装置，其能够产生棘轮效应，从而将循环肿瘤细胞与其他血细胞分离开来；C. 两级连续微流控芯片。一种由圆柱状微柱构成的装置，在第一阶段主要回收大的细胞簇，在第二阶段则通过不对称微柱主要提取较小的细胞簇。
图10. 基于迪恩流分离的循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 倾斜螺旋微流控装置。一种利用迪恩流分离（DFF）原理，借助迪恩涡旋流中的惯性升力，使较大的循环肿瘤细胞聚焦靠近内壁，而较小的血细胞朝向外壁的装置；B. 迷宫式装置。一种由长环形通道和急转弯构成的装置，它利用惯性升力和迪恩流之间的平衡来将循环肿瘤细胞与其他血细胞分离开。
图11. 基于微流控涡旋和惯性迁移的循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 涡旋芯片（Vortex Chip）。一种将微尺度涡旋和惯性聚焦相结合的芯片，具有高纯度、高通量以及高细胞完整性和高细胞活性的特点；B. 高通量涡旋芯片（High Throughput Vortex Chip）。一种相较于涡旋芯片（Vortex Chip）升级了的芯片，其平行通道数量增加了一倍，串联储液池数量增加了 0.5 倍，同时还能使样品废液回流；C. 多流直通道（Multiflow straight channel）。一种基于尺寸依赖型惯性迁移的多流微流控装置。
图12. 基于介电泳的循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. ApoStream®。一种利用正介电泳（DEP）力将循环肿瘤细胞推向电极平面，而其他血液成分则被负介电泳力吸引进入流体流速剖面的装置；B. DEPArray™。一项结合了 CellSearch® 富集技术和非均匀电场，能够以无与伦比的纯度吸引并分离单个循环肿瘤细胞的技术；C. 无线双极电极阵列。一种介电泳装置，它能沿 x 和 y 两个方向在无线双极电极（BPE）尖端周围的电场最大值处吸引并捕获循环肿瘤细胞，而其他血细胞则仍留在流体流中。
图13. 基于形貌的循环肿瘤细胞（CTCs）分离。A. 纳米粗糙表面。一种简单的策略，利用肿瘤细胞与其他血细胞之间不同的黏附偏好来捕获循环肿瘤细胞，具有较高的捕获效率；B. 一种集成微流控系统。一项结合了基于尺寸的富集和基于侵袭性分析的技术，通过提供胎牛血清（FBS）成分来分离并分析循环肿瘤细胞的转移潜能；C. 循环肿瘤细胞竞赛检测法（CTC-Race assay）。一种能够分离出一小部分（11.5%）具有高迁移能力且纯度和活性俱佳的循环肿瘤细胞的检测方法。
图14. 联合分离技术。A. 循环肿瘤细胞集成芯片（CTC-iChip）。一种惯性聚焦增强型微流控循环肿瘤细胞捕获平台，它结合了（1）确定性侧向位移技术以去除红细胞（RBCs）和血小板，（2）惯性聚焦技术使白细胞（WBCs）和循环肿瘤细胞对齐，以及（3）磁泳技术使带有磁性标记的细胞（循环肿瘤细胞或白细胞）发生偏转；B. 整体式芯片。一种自动化芯片，具备 128 重确定性侧向位移、双惯性聚焦阶段以及磁激活细胞分选阶段，实现了出色的回收率；C. 大样本量循环肿瘤细胞集成芯片（LPCTC-iChip）。一种装置，它通过基于尺寸的惯性分离去除红细胞和血小板，利用针对 CD45、CD16、CD3、CD45RA、CD66b 的生物素化抗体混合物通过磁选芯片去除白细胞，最终在 65 毫升的白细胞分离术样本中以良好的捕获效率和超高通量回收循环肿瘤细胞；D. 核酸适配体尾端章鱼芯片（Aptamer-tailed Octopus chip）。一种芯片，它利用带有确定性侧向位移（DLD）图案且经核酸适配体功能化、靶向上皮细胞黏附分子（EpCAM）的金纳米球来捕获循环肿瘤细胞，并借助巯基交换反应释放循环肿瘤细胞，以便进行下游测序和培养；E. 柱形 X 芯片（PillarX）。一种双模块微流控装置，它整合了柱形装置（基于尺寸的）和 X 形磁装置（基于上皮细胞黏附分子 EpCAM 表达的），用于对单个循环肿瘤细胞及细胞簇进行分析。
本文亮点
作为转移的 “种子”，循环肿瘤细胞在癌症诊断、预后及治疗方面展现出了巨大潜力。
循环肿瘤细胞的稀有性和异质性给其在临床实践中的分离及检测技术带来了挑战。
这篇综述对循环肿瘤细胞的生物及物理分离方法进行了总结和比较。
作者：赵月棠
审核：方 俊
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https://link.springer.com/article/10.1007/s44258-024-00044-0
引用格式
Guo, Z., Xia, W. Isolation of circulating tumor cells: recent progress and future perspectives. Med-X 2, 28 (2024). https://doi.org/10.1007/s44258-024-00044-0
作者简介
郭子恒，上海交通大学生物医学工程学院硕士研究生，从事循环肿瘤细胞的鉴别与诊疗相关研究。作为共同作者参与研究PTPRT缺失调控STING信号通路进而增强抗PD-1疗法的肺癌治疗效果（Science Translational medicine， 2024）。
夏伟梁，上海交通大学生物医学工程学院长聘正教授、博士生导师，致远学院副院长。致力于医工交叉研究，聚焦肿瘤等难治疾病的机制和诊疗新靶点发现，外泌体生物学及诊疗应用。担任Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids(EVCNA)副主编。在Science Translational Medicine、Protein Cell、Journal of Extracellular Vesicles、Oncogene等期刊发表约130篇SCI学术论文，H-因子50（谷歌学术），授权专利8项。
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