JIPB | 中国农业大学陈其军课题组开发新型作物引导编辑器PE6c大幅增强了水稻引导编辑

文摘   科学   2024-07-17 11:55   北京  

引导编辑 (Prime editing) 是2019年面世的通用型精准基因组编辑技术,能够实现任意碱基替换、小片段插入或删除 (Anzalone et al., 2019)。尽管引导编辑器 (PE) 在植物中的编辑效率总体上偏低,但持续的迭代更新正在解决这一障碍。目前优化的植物引导编辑器全部基于Moloney小鼠白血病病毒 (M-MLV) 逆转录酶 (RT)。最近,David Liu团队通过噬菌体辅助的连续进化及结构导向的理性设计,优化了三种不同来源的四种逆转录酶变体 (Doman et al., 2023),为植物引导编辑器的进一步优化提供了新的机遇和方向。

JIPB近日在线发表了中国农业大学陈其军课题组题为“PE6c greatly enhances prime editing in transgenic rice plants”的研究论文 (https://doi.org/10.1111/jipb.13738)。该研究开发了六种新型作物引导编辑器,包括PE6a–d、PE6bd和PE6db。在水稻中测试结果显示,新型引导编辑工具PE6c表现出色,在来自15个基因的18个重要农艺性状位点上,平均编辑效率提高了3.5倍以上。这一研究为植物引导基因编辑工具提供了新的选择,为基于引导编辑技术培育具备优良农艺性状的水稻新品种奠定了基础。

研究团队使用三种不同来源的RT变体,构建了四种新型作物引导编辑器PE6a-d,同时将M-MLV RT变体与来自酵母Tf1逆转座子的 RT变体融合,构建了含双RT的新型引导编辑器PE6bd和PE6db。团队选择来自15个基因的18个重要农艺性状的位点,构建了70个双靶点PE载体,然后进行水稻转化及编辑效率的测试。这15个基因的功能包括理想株型 (OsSPL14OsSLR1)、氮素利用效率 (OsNR2OsNRT1.1B)、除草剂抗性 (OsEPSPSOsALSOsACCOsTubA2)、水稻白叶枯病抗性 (OsXa5OsXa23)、非生物逆境抗性 (OsCold1OsTT1) 和营养强化 (OsAKOsDHDPSOsROS) 等。通过深度测序及Hi-TOM方法对70个PE载体转化得到的共3047株转基因水稻进行了突变分析。

值得一提的是,论文通过改进统计分析方法,更准确地量化了PE6相对于PEmax在编辑效率上的提高倍数。结果显示,PE6c的编辑效率相比PEmax提高了3.5倍以上。此外,该研究首次验证了使用来源不同的双RT模块提高引导编辑效率的可行性。研究团队目前正在进一步优化PE6c及其衍生物,测试更多含有双RT模块的PE6变体,以便为作物育种提供更高效的引导编辑工具。

图1. PE6c大幅增强了水稻引导编辑

(A) 双靶点引导编辑载体结构; (B) PE6系统在各个靶点的编辑效率上相较于PE3系统的倍数关系; (C) PE6系统在全部靶点平均编辑效率上相较于PE3系统的倍数关系; (D) PE6c系统相较于PE3系统在编辑效率上的比较, 编辑效率基于纯合突变体比例或基于改进统计方法计算; (E) T0代突变体株系获得预期的表型。

陈其军课题组近年来一直致力于植物引导编辑器的优化。通过提高pegRNA的表达、优化PE蛋白及pegRNA的结构、抑制细胞中DNA错配修复途径等方法,在水稻 (Jiang et al., 2022) 和玉米 (Qiao et al., 2023) 引导编辑器的优化中取得了一系列进展。这篇文章基于酵母Tf1逆转座子的逆转录酶变体开发的作物引导编辑器PE6c,大幅度提高了水稻的精准编辑效率。论文中聚焦的多样化水稻引导编辑靶点及改进的统计方法对于比较不同实验室开发的引导编辑器提供了一个通用性标准,该标准具有更高的可行性、准确性和通用性。

博士生曹正宏孙炜为该论文的共同第一作者,陈其军教授为通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划及国家自然科学基金的资助,水稻转化得到中国农科院作科所吴传银研究员和隋毅博士的帮助。

参考文献:

Anzalone A.V., Randolph P.B., Davis J.R., Sousa A.A., Koblan L.W., Levy J.M., Chen P.J., Wilson C., Newby G.A., Raguram A., and Liu D.R. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576: 149–157.

Doman J.L., Pandey S., Neugebauer M.E., An M., Davis J.R., Randolph P.B., McElroy A., Gao X.D., Raguram A., Richter M.F., Everette K.A., Banskota S., Tian K., Tao Y.A., Tolar J., Osborn M.J., and Liu D.R. (2023). Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors. Cell 186: 3983–4002.e26.

Jiang Y., Chai Y., Qiao D., Wang J., Xin C., Sun W., Cao Z., Zhang Y., Zhou Y., Wang X.C., and Chen Q.J. (2022). Optimized prime editing efficiently generates glyphosate-resistant rice plants carrying homozygous TAP-IVS mutation in EPSPS. Mol. Plant 15: 1646–1649.

Qiao D., Wang J., Lu M.H., Xin C., Chai Y., Jiang Y., Sun W., Cao Z., Guo S., Wang X.C., and Chen Q.J. (2023). Optimized prime editing efficiently generates heritable mutations in maize. J. Integr. Plant Biol. 65: 900–906.

文章引用:

Cao, Z., Sun, W., Qiao, D., Wang, J., Li, S., Liu, X., Xin, C., Lu, Y., Gul, S.L., Wang, X.C., et al. (2024). PE6c greatly enhances prime editing in transgenic rice plants. J. Integr. Plant Biol. https://doi.org/10.1111/jipb.13738
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